Impact de la reparation d’ADN par la voie Microhomology Mediated End-Joining in vivo – i-MMEJ

Dans ce projet, nous avons étudié l'importance des voies MMEJ/NHEJ in vivo, en créant des mutants de Clytia et de poisson zèbre pour les gènes impliqués dans les voies MMEJ ou NHEJ. Quelques gènes cibles connus pour être responsables de la voie MMEJ ont été invalidés en utilisant la technique d'édition de gènes CRISPR/Cas9. L'effet de l’invalidation de MMEJ a été évalué chez l'animal sauvage, sans ou avec traitement par une drogue calicheamicin (Clytia) ou exposition à un rayonnement ionisant (poisson zèbre), utilisés pour induire des DSB. En parallèle, nous avons développé un système de rapporteurs in vivo, afin de comprendre le contexte cellulaire, développemental et physiologique favorisant les voies MMEJ ou NHEJ. Pour ce faire, nous avons établi la méthode de transgénèse médiée par le transposon Tol2 chez Clytia (Weissbourd et al, 2021), méthode qui avait déjà été validée chez le poisson zèbre. De plus, nous avons développé un crible innovant en culture cellulaire pour identifier de nouveaux acteurs de la voie MMEJ. Nous avons également exploité les informations du séquençage transcriptomique en cellules uniques pour découvrir la spécificité cellulalre de la voie MMEJ.

Chez la méduse Clytia hemisphaerica, nous avons découvert que les gènes de la voie MMEJ, ainsi que d'autres composants de la voie de réparation des DSB, sont enrichis dans les lignées de cellules souches pluripotentes, les cellules interstitielles et les cellules germinales, à partir de données RNAseq en cellules uniques. Cette observation est cohérente avec notre observation que la voie MMEJ est dominante pendant l'embryogenèse précoce (Momose et al, 2018), qui retient les protéines maternelles des œufs. L’embryon de Clytia est plus sensible aux dommages causés par les DSB que le stade plus tardif de la méduse. Avec le gène ChePOLQ (ADN polymérase ?), l'oogénèse est gravement perturbée, ce qui indique son rôle critique dans le développement et le maintien de l'ovocyte.
Chez le poisson zèbre, nous avons montré que les gènes impliqués dans la voie MMEJ sont fortement exprimés au cours des premières heures de développement lorsque les cellules se divisent très activement et nous avons vu que dans les embryons 1 dpf, les rayonnements ionisants induisent une augmentation de l'expression des gènes des voies MMEJ et NHEJ.
Nous avons montré un rôle central de Lig4 pour un développement normal, rappelant ce qui est décrit chez l’homme chez l'homme et nous avons constaté que les embryons mutants lig3 et polq étaient très sensibles à DSB contrairement aux mutants lig4. En résumé, nos résultats avec les mutants polq, lig3 et lig4 étendent et confirment l'importance de la voie MMEJ par rapport à la voie cNHEJ.
En cellules humaines nous avons aussi montré l’importance de la réparation par la voie MMEL après coupure par CRISPR (Weber et al, 2020). Pour identifier de nouveaux gènes impliqués dans les voies MMEJ et NHEJ, nous avons développé un nouveau rapporteur de la voie de réparation des DSB dans les cellules humaines et effectué un criblage CRISPR à l'échelle du génome. Un ensemble de 250 gènes candidats a été sélectionné et des expériences de validation sont actuellement en cours.

Nous avons atteint avec succès une grande partie des objectifs du projet. Certaines parties nécessitent l'acquisition de données supplémentaires pour la publication finale, comme nos cultures des resources genetiques (mutants) sont partrubé par la crises sanitaire publique. Les résultats scientifiques du projet i-MMEJ sont extrêmement importants et seront publiés à l'avenir. En outre, ce projet sera evolué en future dans le contexte de la maintenance des cellules souches et des cellules germinales et les rôles des voies de réparation de l'ADN. Les cnidaires sont particulièrement bon modele et connue pour leur sénescence et leur grande capacité de régénération. L’entretien des cellules souches et de l'intégrité génomique est l'une des principales questions à résoudre chez cnidaires.

Momose T, De Cian A, Shiba K, Inaba K, Giovannangeli C, Concordet JP. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Sci Rep. 2018 Aug 6;8(1):11734. doi: 10.1038/s41598-018-30188-0. PMID: 30082705; PMCID: PMC6078951.

Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018 Jul 2;46(W1):W242-W245. doi: 10.1093/nar/gky354. PMID: 29762716; PMCID: PMC6030908.

Weber L, Frati G, Felix T, Hardouin G, Casini A, Wollenschlaeger C, Meneghini V, Masson C, De Cian A, Chalumeau A, Mavilio F, Amendola M, Andre-Schmutz I, Cereseto A, El Nemer W, Concordet JP, Giovannangeli C, Cavazzana M, Miccio A. Editing a ?-globin repressor binding site restores fetal hemoglobin synthesis and corrects the sickle cell disease phenotype. Sci Adv. 2020 Feb 12;6(7):eaay9392. doi: 10.1126/sciadv.aay9392.

A genetically tractable jellyfish model for systems and evolutionary neuroscience.
Weissbourd B, Momose T, Nair A, Kennedy A, Hunt B, Anderson DJ.
Cell. 2021 Nov 24;184(24):5854-5868.e20. doi: 10.1016/j.cell.2021.10.021. (Transgenic methods developed in this project.)

Role of MMEJ in oocyote development in Clytia hemisphaerica
Uveira J., Lechable M. and Momose M. in preparation.

Analyse de l'activité MMEJ et NHEJ chez le poisson zèbre.
Carrara M., Gaillard AL., Brion A., Duvernois-Berthet E., Giovannangeli C., Concordet JP. et Pézeron G. en préparation

DNA is continuously exposed to damage in cells. Among the varieties of DNA damage, double strand breaks (DSBs) are one of the most severe threats to genome integrity. Eukaryotes have multiple evolutionary conserved pathways to repair DSBs, namely homologous recombination (HR), non-homologous end-joining (NHEJ) and the lesser-known microhomology mediated end-joining (MMEJ) pathways. HR is a highly precise DSB repair mechanism by copying sequences from the homologous repair template i.e. sister chromatid. NHEJ is an end-tethering repair mechanism and can generate mutations; thus it is often qualified as “error-prone”. MMEJ has long been considered as a backup pathway for NHEJ and has been characterized by the implication, during DSB repair, of short homologous sequences called microhomologies (MH). In the last decade MMEJ has started to be recognized as an independent pathway, particularly after identification of proteins involved such as DNA polymerase?, but the mechanisms of MMEJ remain largely unclear. Importantly in cultured cells, MH-containing deletions often represent the majority of mutations generated during repair of a targeted DSB, supporting the importance of MMEJ in DSB repair. The different DSB repair pathways are mutually exclusive. How and in which conditions cells select one pathway, is still under investigation. In cultured cells, HR is favoured in S/G2 phases of the cell cycle, when a repair template is available; while NHEJ is active along the cell cycle and very little is known for MMEJ. In parallel, it is reasonable to speculate that another level of DSB repair regulation, depending on the stage of embryonic development and on cell type, is taking place in living animals, which consist of many differentiated or undifferentiated cells, dynamically changing and interacting. Recent observations suggested that MMEJ is critical for animal embryos. In zebrafish embryos, pol?-mutant is highly sensitive to DSB. In C. elegans, pol?-mediated MMEJ is dominant in germline stem cells. In mouse embryos, high frequency of deletions between MH, characteristic of MMEJ, has been observed following TALEN or CRISPR/Cas9-mediated knockout. Moreover, our recent work has shown that MMEJ is acting almost exclusively in early embryos of a jellyfish, Clytia hemisphaerica.
In this project, we aim to address questions about roles and mechanisms of MMEJ. One key feature of our project is to address these questions in developing animals, using zebrafish and Clytia. Therefore, our project includes three axes:

- Characterization of the role of MMEJ in living animals through
(i) Profiling and dynamics of DSB repair genes expression
(ii) Impact of loss-of-function mutations in DSB repair genes on embryonic development

-Determination of cellular, developmental and physiological contexts that favour/disfavour MMEJ over other DSB repair pathways by
(i) Visualization at cellular resolution of DSB repair pathways using fluorescent reporters
(ii) Characterization of repair products including frequency of MMEJ-induced deletions

-Identification of novel genes involved in MMEJ and the balance with other DSB repair pathways, using
(i) A CRISPR-based screen in cultured cells by developing appropriate reporters for the DSB repair pathways
(i) Validation of candidate genes in cultured cells and in the two animal models

Our project combines the expertise of the three partners in developmental biology and genetics of animal models as well as in genome editing and DSB repair. Our project will achieve a to better understanding of how cells within whole animals deal with DSB, how different pathways are switched on depending on the cellular context and finally to better characterize the MMEJ pathway. In addition, we will exploit our data to improve precise genome modification in genome editing approaches.