Caractérisation de l’enzyme épigénétique TET: une approche intégrée. – EpiTET

Pour réaliser ce projet, nous utiliserons une combinaison d'approches développementales, moléculaires, génétiques, génomiques et bioinformatiques, permettant d'aborder différentes questions sur le mode d'action de TET.
Pour étudier la fonction de TET dans l'hématopoïèse et la répression des éléments transposables (dans l'ovaire), nous utiliserons essentiellement des approches génétiques in vivo avec différents allèles mutants de TET et des inhibitions tissue-spécifique de son expression par RNAi. Des expériences d'imagerie confocal avec différents marqueurs connus ou des lignées transgéniques rapportrices, ainsi que des expériences de RNA-seq seront employées pour caractériser les conséquences de la perte de fonction de TET et pour identifier les voies de signalisation affectées.
En parallèle, nous utiliserons des technologies de pointe de séquençage à haut débit (ChIP-seq, TRAP, RIP, Nanopore sequencing...) pour identifier les cibles de TET au niveau ADN et/ou ARN et pour caractériser son impact sur différentes modifications épigénétiques et/ou épitranscriptomiques.
Enfin, pour identifier des partenaires et des régulateurs de TET, nous mettrons en oeuvre deux stratégies complémentaires: une approche protéomique pour purifier TET et ses partenaires, et un crible génétique pour identifier des modificateurs des phénotypes associés à la diminution de l'expression de TET.

Nous avons développé de nouveaux outils pour étudier TET de Drosophile. Grâce à la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré in vivo et ex vivo une nouvelle version taggée avec la GFP de TET, qui permet de suivre l'expression des deux isoformes de TET (TET-l et TET-s). Avec une stratégie similaire, nous avons obtenu un allèle mutant de TET dépourvu d'activité enzymatique, qui sera complémentaire des allèles amorphes dont nous disposions déjà. Enfin, nous avons produit et testé différents anticorps dirigés contre TET.
Nos résultats montrent que TET-s est exprimé dans l'ensemble des cellules sanguines de Drosophile, mais son expression est réprimée dans un des lignages hématopoïétqiues. Dans les ovaires, TET-s est exprimé dans les cellules follicullaires mais pas dans les cellules germinales. TET-l ne semble exprimé ni dans les cellules sanguines ni dans les ovaires, indiquant que le domaine présomptif de liaison à l'ADN de TET, présent uniquement dans TET-l, n'est pas requis pour sa fonction dans ces tissus.
Nos analyses des mutants TET (amorphes) montrent que TET est requis pour l'homéostasie du système hématopoïétique larvaire. Sur la base des résultats de nos RNA-seq, nous avons identifié de nombreux gènes régulés par TET spécifiquement dans les cellules sanguines. Nous sommes en train d'analyser les résultats de RNA-seq et small-RNA-seq d'ovaire pour caractériser l'impact de TET sur la production de piRNA et la répression des éléments transposables.
De façon intéressante, l'étude du mutant TET catalytic dead nous a permis de mettre en évidence que l'activité enzymatique de TET n'est pas requise pour l'ensemble de ses fonctions, notamment la viabilité et la fertilité.
Finalement, un crible génétique à grande échelle nous a permis d'identifier de nombreux loci qui aggravent ou diminuent les phénotypes causés par une inhibition de l'expression de TET dans l'aile. Certain des gènes responsables de ces interactions génétiques ont pu être identifiés.

D'une part, nous poursuivrons la caractérisation de la fonction de TET dans l'hématopoièse et dans la répression des éléments transposables en nous appuyant sur nos résultats de RNA-seq, et nous chercherons à identifier plus précisément les cellules dans lesquelles TET agit en utilisant des approches de perte de fonction tissus/lignage spécifique. Afin de caractériser l'impact de TET sur les modifications de l'ADN, nous mettrons en oeuvre des expériences de séquençage de 3ème génération qui permettent d'identifier à l'échelle du génome et à la base près la nature des modification épigénétiques. Ces expériences seront couplées à des analyses de ChiP-seq contre TET afin d'identifier les cibles directes de cette enzyme.
D'autre part, nous poursuivrons la caractérisation comparative des allèles mutants TET null et «catalytic dead« afin de déterminer les fonctions dépendantes et indépendantes de son activité enzymatique.
Enfin, nous poursuivrons la caractérisation fonctionnelle des interacteurs génétiques de TET que nous avons identifié dans notre crible et nous chercherons à améliorer nos méthodes de purification de TET afin de pouvoir identifier ses partenaires directes par une approche protéomique.

A ce jour, une publication et un chapitre de livre dans des revues internationales à comité de lecture ont été publiés avec le soutien de ce financement ANR:
Duc C et al., Genome Biology, 2019 Jun 21;20(1):127.
Boulet Met al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2018 vol. 1076, pp195-214.

Nos travaux sur le projet ont aussi fait l'objet de 6 présentations à des congrès nationaux ou internationaux.

Un contrôle précis de l’expression des gènes est crucial pour assurer le développement des organismes et le maintien de leur homéostasie, et donc pour prévenir l’émergence de nombreuses pathologies. Ainsi, il est primordial de déchiffrer les mécanismes fondamentaux de l’expression des génomes. Les enzymes qui modifient l’ADN ou l’ARN jouent un rôle de premier plan dans la régulation de l’expression génique au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel. De ce fait, un enjeu essentiel est de comprendre les fonctions biologiques et les modes d’action de ce type d’enzymes.
Du fait de leur capacité à oxyder les méthyl-Cytosines (mC), une modification épigénétique majeure dans de nombreux génomes, les enzymes de la famille TET (Ten Eleven Translocations) sont des acteurs clés de la déméthylation de l’ADN. Ces enzymes sont impliqués dans de nombreux processus physiopathologiques, notamment dans le système hématopoïétique. Or, si la plupart des travaux s’est concentrée sur leur rôle en relation avec l’oxydation des mC de l’ADN, ces protéines oxydent aussi les méthyl-Cytidines des ARN et certaines de leurs fonctions semblent indépendantes de leur activité enzymatique. De plus, les mécanismes par lesquels elles contrôlent le destin des cellules, la nature de leurs partenaires et les modes de régulation de leur activité restent très mal connus.
La Drosophile, dont le génome est quasiment dépourvu de mC, code pour une protéine TET et représente donc un organisme modèle unique pour étudier ces enzymes par delà leur rôle dans l’oxydation des mC de l'ADN. L’objectif global de ce projet est de parvenir à décrypter la fonction et le mode d’action de TET de Drosophile dans deux paradigmes principaux, l’hématopoièse et la répression des éléments génétiques mobiles, grâce à des approches génétiques, développementales, moléculaires, génomiques et bioinformatiques. En nous appuyant sur les outils disponibles chez la Drosophile et sur l’expertise complémentaire des équipes du consortium, nous chercherons à déterminer comment TET contrôle le destin des cellules et la stabilité des génomes, ainsi qu'à identifier ses cibles, ses partenaires et ses régulateurs.
Nos résultats récents montrent que TET contrôle l’homéostasie du système sanguin de la Drosophile, dont le développement présente des similitudes importantes avec celui des mammifères. Grâce à l’expertise de l’équipe 1, nous caractériserons la fonction de TET dans l’hématopoïèse et nous définirons le réseau génique qu’il contrôle. D’autre part, il a été montré que TET contrôle la répression des éléments transposables, qui est essentielle à la stabilité des génomes, et nos données suggèrent qu’il agit sur la voie des piRNA, un système conservé de répression des éléments génétiques mobiles. Avec l’équipe 3, nous explorerons comment TET contrôle les loci génomiques et/ou les ARN impliqués dans la répression des éléments transposables. En parallèle, nous utiliserons des techniques NGS et bioinformatiques de pointe maitrisées par l’équipe 2 pour définir si TET agit au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel et pour identifier ses cibles ADN et/ou ARN. Enfin, nous emploierons une approche protéomique et un crible génétique pour identifier des partenaires et des régulateurs de TET, dont nous étudierons la fonction et le mode d’action dans l’hématopoïèse et la répression des éléments transposables.

Ce projet apportera une vision mécanistique approfondie de la fonction et du mode d’action de TET et ouvrira de nouveaux axes de recherche sur cette famille conservée d’enzyme de modification de l’ADN et de l’ARN. Nos découvertes contribueront aussi à une meilleure compréhension du développement des cellules sanguines et de la répression des éléments transposables. Enfin, nos résultats auront une répercussion importante sur notre conception des mécanismes de régulation de l’expression et de la stabilité des génomes ou du destin cellulaire, avec des implications importantes en santé humaine.