Conformations des formines lors de l'assemblage des filaments d'actine – CONFORMIN

Il s'agit d'un travail in vitro, à partir de protéine purifiées. A partir de ces protéines, deux techniques principales sont mises en œuvre : la microscopie électronique et les pinces magnétiques. La première permet une observation directe des formines en interaction avec des filaments d'actine. La seconde permet de sonder l'extension des domaines FH1.

A ce stade du projet, nous avons mis au point les protocoles de préparation des échantillons pour la microscopie électronique, et nous avons élaboré les différentes constructions protéiques que nous utiliserons pour les expériences de pinces magnétiques.

Nous sommes encore au début du projet. Les expériences vont pouvoir se poursuivre, et de nouvelles expériences vont pouvoir démarrer avec nos nouvelles constructions protéiques. Nous pensons pouvoir obtenir des observations directes des conformations des domaines FH2 au bout barbé des filaments, et caractériser l'extension des domaines FH1.

Ce travail est en cours, et n'a pas encore donné lieu à publication.

Les formines sont des régulateurs essentiels de l’assemblage de l’actine, permettant l’élongation rapide des filaments, donnant typiquement lieu à des structures comportant des paquets de longs filaments, comme les filopodes ou l’anneau de cytocinèse. Les formines sont impliquées dans des processus cellulaires importants et diverses maladies, telles que les angiopathies, les neuropathies et le cancer.

Les formines fonctionnent en homodimères, pour traquer le bout barbé d’un filament en croissance (grâce à leurs domaines FH2) tout en accélérant son élongation à partir de profiline-actine (grâce à leurs domaines FH1), conduisant ainsi à la formation rapide de longs filaments. Depuis une dizaine d’années, les formines ont reçu beaucoup d’attention, et plusieurs de leurs propriétés ont été élucidées. Etonnamment, les changements de conformations impliqués dans le fonctionnement des formines, bien qu’essentiels pour comprendre leur activité, ne sont encore qu’hypothétiques. Ces conformations fonctionnelles n’ont jamais été observées. Sur la base d’observations biochimiques, biophysiques et structurales, un modèle global de la formine émerge cependant aujourd’hui. Il propose que le dimère de FH2 soit en équilibre rapide entre deux conformations au bout barbé en croissance, et que le domaine FH1 constitue une chaîne flexible qui explore l’espace autour du bout barbé pour lui fournir des monomères d’actine. Des observations récentes donnent lieu à une série de résultats paradoxaux qui montrent que ce modèle, bien qu’étant sans doute correct dans les grandes lignes, ne permet pas de rendre compte de l’ensemble des propriétés essentielles des formines.

Notre compréhension de cette activité est encore limitée par notre ignorance des conformations adoptées par les formines. Nous proposons de combiner diverses approches in vitro pour révéler ces conformations fonctionnelles, et tester des prédictions issues de nos études préliminaires. La microscopie électronique sur des échantillons contrôlés nous fournira les premières images des conformations du dimère FH2 sur un filament d’actine. Les éventuelles modifications locales de la conformation du filament d’actine seront également scrutées. Les conformations et la dynamique des chaînes FH1 flexibles seront étudiées grâce à des pinces magnétiques, en plus d’expériences de microfluidique. L’affinité de la chaîne FH1 pour la profiline et la profiline-actine sera mesurée, ainsi que le couplage de cette affinité avec la tension appliquée. Les éventuelles interactions entre les domaines FH1 et FH2, qui pourraient expliquer certains résultats surprenants récents, seront également étudiées avec des pinces magnétiques.

Le laboratoire du coordinateur (partenaire 1) est un expert de l’assemblage de l’actine et a récemment produit des résultats importants sur les formines, par des approches biochimiques et grâce à une nouvelle technique combinant la microfluidique et la microscopie optique. Le partenaire 1 sera en mesure de produire les protéines requises pour ce projet, et de générer les échantillons adéquats pour les observations de microscopie électronique, qui seront conduites par le partenaire 2 qui est une experte de ces techniques, ainsi que pour les expériences de pinces magnétiques qui seront conduites par le partenaire 3, un expert reconnu de la manipulation de biomolécules avec cet outil. Nous sommes convaincus que nos expertises combinées assureront le succès de ce projet ambitieux.