Fonctions émergentes d’un inhibiteur de p53: une organisation macromoléculaire flexible pour des fonctions biologiques distinctes – flexiplex

Les équipes de Sarah Cianférani, Carine Van Heijenoort et Ali Badache apportent leur expertise complémentaire dans le domaine de la biologie structurale et cellulaire afin de définir l’organisation supramoléculaire et dynamique du complexe iASPP.
Approches moléculaires : cartographie moléculaire des interactions protéine-protéine ; analyse de séquence pour l’identification de régions ou motifs conservés ; identification de sites de phosphorylation par spectrométrie de masse ; mutagénèse dirigée, impact sur l’interaction entre iASPP et ses partenaires (co-immunoprécipitation, biotinylation de proximité)
Approches cellulaires : localisation de iASPP, colocalisation de iASPP et de ses différents partenaires au niveau subcellulaire par microscopie de haute résolution (Airyscan), de super-résolution ou PLA.
Approches fonctionnelles : utilisation d’ARNi pour inhiber l’expression de iASPP et partenaires ; utilisation de mutants d’interactions, de phosphorylation : évaluation de l’impact sur la dynamique des microtubules, la migration cellulaire, l’organisation du fuseau mitotique, l’expression de cibles de p53.
Approches structurales (résolution atomique): iASPP comprend une très longue région N-terminale désordonnée. La flexibilité inhérente de ce type de régions et le caractère transitoire de leurs interactions est un obstacle à la cristallisation. La RMN permettra l’analyse des propriétés dynamique de cette région, et révélera les changements structuraux associés aux interactions intra- et intermoléculaires. Une approche de spectrométrie de masse structurale native, couplée à la mobilité ionique (IM-MS) sera utilisé en complément pour la caractérisation conformationnelle des régions désordonnées.
Approches structurales (résolution moléculaire): Des approches par MS structurale et SAXS permettront de compléter les données obtenues par RMN, et fourniront des données sur la compacité et l’organisation de iASPP seule et en complexe avec ses partenaires.

Durant ces premiers mois, nous avons clairement identifié un rôle de iASPP dans le contrôle des microtubules, avec des conséquences sur la migration et la division cellulaire.
Nous avons identifié des domaines fonctionnels et des motifs impliqués dans l’interaction avec ses nouveaux partenaires
Nous avons identifié des sites de phosphorylation.
Nous avons mis en place des méthodes de purification des principaux composants des complexes.

Le rôle de la phosphorylation de iASPP dans l’interaction avec ses partenaires sera analysé grâce à l’utilisation de mutants des sites de phosphorylation principaux.
Les protéines purifiées seront analysées par MS native pour caractériser l’architecture de iASPP isolément ou en association avec ses partenaires. Les interactions entre partenaires seront analysées par cross-linking MS et HDX.
Les méthodologies de purification seront améliorées pour produire les quantités et concentrations nécessaires pour l’analyse RMN. L’attribution des spectres RMN sera faite pour iASPP, EB1 et PP1.
L’intégration des analyses RMN et native MS devrait nous permettre de comprendre comment iASPP engage différents types d’interaction avec ses partenaires pour contrôler des fonctions biologiques distinctes.

Article co-publié par partenaire 1 et 3.
EB1-binding-myomegalin protein complex promotes centrosomal microtubules functions. Bouguenina H, Salaun D, Mangon A, Muller L, Baudelet E, Camoin L, Tachibana T, Cianférani S, Audebert S, Verdier-Pinard P, Badache A. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Dec 12;114(50):E10687-E10696. doi: 10.1073/pnas.1705682114.

Les modules fonctionnels à l’œuvre dans les organismes vivants sont très généralement formés de complexes protéiques multimériques, organisés en réseaux d’interactions dynamiques. L’élucidation de la conformation et des propriétés dynamiques des protéines dans ces réseaux est de la première importance pour pouvoir s’attaquer au défi des pathologies humaines. La protéine iASPP est un inhibiteur connu de la fonction pro-apoptotique du suppresseur de tumeur p53. Nos données suggèrent pourtant qu’iASPP, de par sa capacité à interagir avec une protéine associée aux microtubules et avec la phosphatase PP1, aurait des fonctions encore inexplorées indépendante de p53 ; et implique qu’iASPP est une protéine dite « moonlighting » qui aurait progressivement acquis, au cours de l’évolution, de nouveaux déterminants moléculaires et donc de nouvelles fonctions, notamment pour le contrôle de la motilité et la division cellulaires. Les équipes de Sarah Cianférani (CNRS, Strasbourg), Carine Van Heijenoort (CNRS, Gif sur Yvette) et Ali Badache (Inserm, Marseille), partageant leurs expertises complémentaires dans le domaine de la biologie structurale et cellulaire, proposent un projet visant à définir l’organisation supramoléculaire et dynamique du complexe iASPP. Ce projet impliquera la mise en place d’un processus collaboratif associant étroitement les analyses RMN et les méthodologies de spectrométrie de masse structurales aux études de la cartographie subcellulaire des complexes et de leurs fonctions biologiques. Il nécessitera également l’implémentation d’outils informatiques dédiés, capables d’intégrer à la fois les données atomiques - RMN, cristallographie aux rayons X-, les données topologiques - SAXS, spectrométrie de masse à mobilité ionique - et les contraintes moléculaires - spectrométrie des échanges hydrogène/deutérium et des pontages chimiques-, qui permettront de proposer un modèle structural et fonctionnel intégré. Ce projet établira comment les différentes entités supramoléculaires d’iASPP s’organisent au niveau atomique, moléculaire et cellulaire pour orienter le devenir de la cellule.