Exploration in vivo du couplage métabolique entre neurones et astrocytes lors de l'activation cérébrale: étude par spectroscopie de RMN – INNES

Le but original de ce projet sera d'explorer le métabolisme cérébral directement (i) sur les biopsies cérébrales (en utilisant la spectroscopie RMN Haute Résolution à l'Angle Magic -HRMAS), après perfusion de 13C-glucose et 13C-lactate sur des rats éveillé et unilatéral stimulés; et (ii) in vivo sur des rats stimulés unilatéralement, en utilisant une spectroscopie RMN 1H localisée et une spectroscopie RMN 13C après injection de substrat 13C. La stimulation neuronale est obtenue grâce à la stimulation des vibrisses droites, ce qui entraîne une activité fonctionnelle dans le cortex somatosensoriel (S1BF) gauche. Chaque animal sera son propre contrôle car la stimulation des vibrisses sera effectuée unilatéralement. Ces deux approches RMN nous permettront d'analyser à la fois (i) l'état stationnaire isotopique et (ii) des études métaboliques dynamiques lors de l'activation cérébrale.
Le deuxième but original de ce projet sera de travailler à la fois sur des rats témoins et des rats qui seront réprimés pour les transporteurs de lactate neuronaux (MCT2) ou gliaux (MCT1 ou MCT4). Ces rats génétiquement modifiés seront obtenus par injection d'adénovirus (shRNA).
En effet, les MCT sont des transporteurs clés dans la navette lactate entre astrocytes et neurones (ANLS) qui sont utilisés pour transférer le lactate astrocytaire aux neurones lors de l'activation cérébrale. Cependant, cela n'a jamais été démontré in vivo. Une caractérisation de l'expression des protéines ainsi que le remodelage des protéines liées à l'activation cérébrale et à la plasticité synaptique (par exemple MCTs, Arc, zif268, GLAST, GLT1, etc.) seront effectués en parallèle à ces études métaboliques. Les résultats donneront une vue d'ensemble (moléculaire et métabolique) sur la coopération intercellulaire qui se produit entre les neurones et les astrocytes pendant et après l'activation cérébrale.

A ce stade du projet, les animaux modifiés génétiquement pour 2 des 3 transporteurs ont été brillamment et rapidement obtenus. Quant au développement technologique, nous sommes désormais capable d'acquérir avec un bon rapport signal-sur-bruit les mesures de métabolites in vivo par RMN du 1H.
De façon plus détaillée:
- Partenaire suisse: l'équipe a développé tous les adénovirus nécessaires pour obtenir les animaux modifiés génétiquement (MCT2, 4 et 1). La répression de MCT2 et de MCT4 a été validée in vitro puis in vivo, par rtqPCR et par Western Blot. Il faut noter les bons résultats obtenus, avec des taux de répression des protéines visées très élevées, surtout pour MCT4.
- Partenaire français: Le RMSB a observé et quantifié les modifications de métabolites, du lactate notamment, lors de l'activation cérébrale in vivo par spectroscopie localisée. Le lactate, difficilement quantifiable car situé dans une zone polluée par les lipides sur les spectres est désormais quantifiable de façon fiable et nous avons pu mettre en évidence une augmentation de lactate lors de l'activation cérébrale. De façon très intéressante, cette augmentation n'est plus visible chez les rats MCT2 et MCT4. Afin de comprendre ce résultat, nous avons entrepris de faire de l'IRM fonctionnelle: nous avons pu mettre en évidence une perte de l'effet BOLD, et donc de l'activation neuronale, chez ces rats MCT2 et MCT4. Après les analyses in vivo, ces rats (éveillés) ont été perfusés avec du [1-13C]glucose lors de l'activation cérébrale. L'ISM et l'UMR3685 ont fabriqué/amélioré une microantenne pour suivre en temps réel les métabolites traversant la sonde de microdialyse implantée dans la zone activée du rat (S1BF). L'instrumentation et le protocole de spectroscopie en ligne du microdialysat ont été validés in vitro et in vivo chez des animaux contrôles. Suite à cette validation, 36 animaux implantés avec des sonde de microdialyse dans le S1BF ont été étudiés.

Partenaire suisse: L'analyse de la répression de MCT1 in vitro a été effectuée et la validation in vivo reste à faire. Son expression étant plus ubiquitaire, il faudra utiliser une technique adaptée pour pouvoir mettre en évidence sa répression (cell sorting par facs flow suivi de rtqPCR envisagé).
Partenaire français: Toutes les biopsies cérébrales sont en attente d'analyse par RMN ex vivo (sonde HRMAS). L'ensemble des expérimentations décrites plus haut devra être reconduit sur les rats MCT1. Côté microantenne: Les résultats obtenus sont en cours d’analyse avant synthèse et publication des résultats. L'analyse sur les rats modifiés génétiquement reste à faire. Des cinétiques en dehors de l'aimant sont envisagées.

Un article a déjà été publié, un second est en cours de révision (référençant l'ANR comme source de financement). De nombreuses communications ont été données également sur ces résultats.

Etat de l’art : de nombreux résultats récents indiquent que le lactate est utilisé de façon importante par le système nerveux central comme substrat énergétique du métabolisme oxydatif. Les données les plus convaincantes sur son utilisation spécifique par les neurones ont été obtenues grâce à la spectroscopie RMN du 13C, illustrant la puissance de cette méthode pour l’étude du métabolisme. Cependant, la plupart de ces études RMN a été réalisée in vitro ou ex vivo sur des extraits par acide perchlorique. Or ces procédures ont d’importantes limitations et peuvent introduire des biais dans les mesures.

Objectif du projet : implémenter de nouvelles approches RMN afin d’étudier le métabolisme cérébral lors de l'activation neuronale et évaluer la validité d'une navette lactate entre astrocyte et neurone (ANLSH) afin de déterminer l'utilisation préférentielle du lactate ou du glucose par les neurones lors de l’activation cérébrale.

Originalité du projet : l’originalité du projet sera de travailler (i) directement sur les biopsies de cerveau, après perfusion de substrats marqués au 13C sur des rats éveillés et stimulés unilatéralement. La stimulation neuronale sera obtenue par la stimulation des vibrisses droites, qui induit une activation fonctionnelle dans le cortex somato-sensoriel gauche. Afin d’analyser le métabolisme cérébral à l’état d’équilibre isotopique dans des biopsies du cerveau, des perfusions simultanées de glucose et de lactate ([1-13C]glucose+lactate ou glucose+[3-13C]lactate) seront réalisées durant 1h. La stimulation des vibrisses sera réalisée de façon unilatérale ainsi chaque animal sera son propre contrôle. A la fin de la perfusion, les rats seront euthanasiés par micro-ondes, pour éviter tout métabolisme post-mortem. Les zones activées et controlatérales seront prélevées et analysées par spectroscopie HRMAS pour déterminer les enrichissements spécifiques en carbone des métabolites (des résultats préliminaires sur 4 rats ont montré de grandes différences entre les régions activées et non-activées).
Parallèlement, des études dynamiques et en temps réel du métabolisme cellulaire grâce à des acquisitions RMN de substrats enrichis en carbone-13 seront réalisées pour répondre à des questions clés sur le fonctionnement du métabolisme cérébral durant l’activation fonctionnelle. Des protocoles de SRM du 13C seront développés afin d'augmenter de façon très importante la sensibilité de détection in vivo (micro antenne, micro-dialyse cérébrale) et seront appliqués pour analyser le métabolisme énergétique cérébral lors la stimulation cérébrale in vivo.

En combinant ces protocoles de RMN, le programme de recherche donnera un éclairage sur l’utilisation préférentielle du lactate ou du glucose par les neurones durant l’activation cérébrale. De plus, les mêmes procédures expérimentales seront réalisées sur des rats génétiquement modifiés par transfection lentivirale pour réprimer les transporteurs au lactate (MCT2, MCT1 et MCT4). En effet, les MCTs sont les transporteurs aux monocarboxylates décrits dans le modèle ANLSH comme les transporteurs utilisés pour le transfert du lactate astrocytaire vers les neurones lors l’activation cérébrale. Ces rats seront obtenus grâce à de nouveaux vecteurs cellule-spécifiques (dirigés contre les astrocytes ou les neurones) permettant la surexpression ou bien la répression de gènes dans le système nerveux central (des résultats préliminaires ont montré l’efficacité de cette technique).

Résultats attendus : Ce programme de recherche permettra de déterminer, pour la première fois in vivo, l’existence d’une utilisation spécifique du lactate astrocytaire par les neurones lors de l’activation cérébrale, résultat manquant essentiel à la validation du modèle ANSLH.