Séquençage haut débit (NGS) pour le développement de nouveaux marqueurs génotypiques chez Francisella tularensis : implications pour la surveillance épidémiologique de la tularémie en France et dans le domaine de la bio-défense. – TULASEQ

Francisella tularensis est l’agent étiologique de la tularémie, zoonose à déclaration obligatoire en France à la fois en santé humaine depuis 2002 dans le cadre de la réactivation du plan Biotox et en santé animale depuis le décret n°2006-179 du 17 février 2006. F. tularensis est également un agent de la menace biologique, de la classe A du CDC. Cette espèce bactérienne présente une faible diversité génétique. Quatre sous-espèces sont actuellement reconnues : tularensis (type A), holarctica (type B), mediasiatica et novicida. Le type A est classiquement présent en Amérique du Nord, le type B dans tout l’hémisphère nord, et la sous-espèce mediasiatica en Asie centrale. Les méthodes de génotypage actuelles (MLVA, PFGE, MLST) n’ont pas un pouvoir discriminant élevé vis-à-vis des souches d’une même sous-espèce. Ces différentes méthodes sont peu utilisées dans les laboratoires de référence et n’ont permis de différencier qu’un faible nombre de génotypes en Europe. Notre projet a pour objectif d’acquérir, par des approches de séquençage génomique global, une meilleure connaissance de la diversité génétique existant parmi les souches de F. tularensis subsp. holarctica isolées en France, et de développer de nouveaux outils de typage moléculaire de haute résolution capables d’identifier l'origine précise (source, zone géographique, etc.) d'une souche dans notre pays et ainsi reconnaitre toute souche importée. Le séquençage de 400 souches d’origine humaine et animale et l’analyse des données de séquençage par bio-informatique comparative qui en résultera devraient permettre l’identification de nouveaux marqueurs génétiques, comme les Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) et les mutations par « INsertion / DELetion » INDELs. Ces signatures ADN sont indispensables pour une identification et une caractérisation de ce pathogène au niveau de la souche. Certains SNPs sont liés à des variations de virulence ou de résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Il est certain que le développement d’une ou plusieurs nouvelles stratégies de génotypage de F. tularensis pourra présenter un intérêt universel. De ce fait, les compétences qui seront développées dans le cadre de ce projet donneront à la France des capacités de réaction rapide face à une demande urgente de caractérisation d'une souche d'origine inconnue. Plusieurs applications sont envisagées pour valoriser les résultats de notre étude. La technologie de fusion haute résolution (HRM) est un outil moléculaire de choix pour caractériser les nouveaux SNPs mis en évidence par analyse in silico. Cette technique permettra de valider des signatures ADN spécifiques des isolats analysés ou des sous-groupes auxquels ils appartiennent, ainsi que l’identification de marqueurs discriminant les souches entre elles. Ces nouveaux marqueurs génétiques doivent apporter une résolution supplémentaire à intégrer dans le développement d’un outil épidémiologique de typage de haute résolution utilisable en routine, soit à partir de souches bactériennes isolées, soit directement à partir de prélèvements biologiques humains, animaux ou environnementaux, mais également pour l’expertise d’échantillons suspects dans le cadre du réseau Biotox-Piratox.