Imagerie fonctionelle à haute resolution de l’activité neuronale par microscopie à modulation de front d’onde – WaveFrontImag

L’imagerie calcique et du voltage peuvent révolutionner notre compréhension sur la façon dont les cellules et les circuits neuronaux traitent et stockent les informations dans le cerveau. Pour explorer les mécanismes sous-jacents de la transmission synaptique, les potentiels de membrane et les transitoires calciques peuvent être mesurés au niveau des dendrites et des épines des neurones où les contacts synaptiques sont formés. De nos jours, l'imagerie calcique et du voltage sont efficacement mises en place grâce à l’utilisation d’un éclairage en champs-entier ou par une illumination à balayage local à deux photons. La première stratégie, combinée avec un appareil de détection type caméra, permet des mesures multi-sites mais cette celle-ci est limitée dans la résolution spatiale et la profondeur de la pénétration. La deuxième stratégie permet une imagerie en profondeur avec une diffraction limitée des volumes excités, mais cette méthode est limitée dans la résolution temporelle pour les enregistrements multi-sites. Ici, nous proposons de développer une nouvelle méthode combinant les avantages de ces deux stratégies. La définition précise de la forme et de l'intensité d'excitation sera réalisée par la mise en forme de front d'onde de faisceaux laser pulsés. Plus précisément, nous utiliserons la technique de contraste de phase généralisée combiné avec une focalisation temporelle pour éclairer les régions cellulaires ou subcellulaires spécifiques en association avec une nouvelle caméra sCMOS qui permettra acquisitions a haute vitesse. Contrairement à l’éclairage champs-entier 1-photon, l’excitation à motifs axialement précis permettra de réduire au minimum la dégradation du signal résultant de la fluorescence non spécifique diffusée par les structures marquées à proximité. Au contraire des approches de balayage à 2-photons, l'utilisation d’excitation parallèle permettra d’améliorer la résolution temporelle. Finalement, pour éclairer avec une forte intensité lumineuse les régions les plus obscures /profondes sans saturer les régions les plus brillantes, nous utiliserons des projections de gradient d'intensité réalisant ainsi une fluorescence de repos uniforme et un rapport Signal sur bruit optimal. De plus, nous testerons cette imagerie améliorée en utilisant des protocoles d'électrophysiologie bien établies sur des tranches de cerveau au niveau de neurone individuellement remplis d’ indicateurs de calcium et de colorants sensibles au voltage . Dans la dernière partie du projet, nous utiliserons notre méthode d'imagerie pour étudier le potentiel de membrane et les signaux calciques dans les neurones de Purkinje du cervelet en se concentrant sur des signaux présent au niveau des dendrites et des épines. En particulier, nous nous concentrerons sur l'enregistrement des courants calciques rapides induites par les canaux calciques voltage-dépendants au niveau dendritiques en utilisant une méthodologie nouvelle basée sur une imagerie calcique ultra-rapide avec l’utilisation d’indicateurs Ca2+ à faible affinité. Ces mesures permettront de mieux comprendre le rôle des canaux calciques voltage-dépendants au niveau dendritiques dans la signalisation synaptique au niveau du cervelet. Par ailleurs, l'exploitation commerciale de la technologie développée dans ce projet sera réalisée au travers des collaborations industrielles déjà existantes. Ce projet sera financé en partie par le LabEx « Canaux ioniques sciences et thérapeutique " et par l’infrastructure nationale France Bio-Imaging.