Méthode de sectionnement optique pour la nanoscopie 3D par localisation de molécules individuelles pour l'étude des processus morphologiques – soSPIM

Développer la capacité de suivre en 3D et avec des résolutions nanométriques des structures cellulaires dans leur environnement natif serait un progrès majeur pour de nombreux domaines de la biologie. Nous proposons d’unir l’expertise d’ingénieurs en optique, d’informaticiens et de biophysiciens ayant un intérêt majeur pour la biologie, afin de développer un prototype de nanoscopie 3D par sectionnement optique. Ce projet repose sur la combinaison d’un système d’éclairage par feuille de lumière simple-objectif, de microfabrication et d’un dispositif de correction de front d'ondes. Nos résultats préliminaires, basés sur des méthodes innovantes brevetées en copropriété pour l’éclairage SPIM simple-objectif et la culture cellulaire contrôlée (5 brevets par les 3 partenaires), constituent une preuve de notre capacité à construire un système abordable de nanoscopie 3D rapide en profondeur.

Le phénomène de diffraction limite la résolution des microscopes conventionnels à environ 200 nm. Ces dernières années, plusieurs techniques d’imagerie émergentes, dites de super-résolution ou nanoscopie, ont permis de contourner cette limite. Les techniques de molécules individuelles, utilisant des protéines fluorescentes encodées génétiquement (PALM) ou des fluorophores organiques ((d)STORM), sont certainement les plus prometteuses. Non seulement elles permettent d’atteindre des résolutions spatiales quasi moléculaires dans des échantillons biologiques, mais elles ont aussi démontré leur capacité à pouvoir quantifier l'organisation et la dynamique de biomolécules avec une relative simplicité. Initialement développées pour l'observation 2D, ces techniques souffrent encore de limites, plus particulièrement dans leur capacité à acquérir des images d’échantillons biologiques entiers en 3 dimensions. De nombreux efforts ont été réalisés ces dernières années pour améliorer la résolution axiale et la profondeur de pénétration qui reste encore limitée au 1er micron à proximité de la lamelle. La microscopie à feuille de lumière a permis d’augmenter les capacités de sectionnement optique pour observer les processus morphogénétiques à l’échelle de l’embryon. Néanmoins, les contraintes techniques de cette approche ne permettent pas aisément la détection de molécules individuelles avec des objectifs à forte ouverture numérique. Il n’existe aujourd’hui aucune solution optimale permettant l’imagerie 3D d’une cellule entière à l’échelle de la molécule unique.

Nous avons récemment réussi à combiner les techniques de SPIM et de localisation de molécules individuelles grâce à une technique brevetée appelée « soSPIM ». Ce projet consiste à i) optimiser notre approche grâce notamment à l’intégration d’optiques adaptatives, ii) développer un prototype industriel et iii) l’utiliser pour étudier les processus de formation morphogénétique des canalicules biliaires à l’échelle de la molécule individuelle. Sur la base de notre preuve de concept, nous proposons de développer un prototype innovant de nanoscopie 3D en profondeur compatible avec les microscopes conventionnels, permettant la localisation 3D de molécules individuelles « in cellulo » dans un volume d’environ 50x50x50 µm3. Scientifiquement, ce projet implique des développements innovants dans les domaines de la molécule unique, de l’analyse d’images, de la microfabrication et de la compréhension des processus morphogénétiques. Industriellement, ce projet nécessite du prototypage, du développement logiciel et du développement de processus de microfabrication à grande échelle. Notre consortium a l’expertise et les compétences scientifiques et industrielles pour mener à terme ce projet à fort potentiel de valorisation sur le marché croissant de la nanoscopie optique. Nous attendons de notre méthode qu’elle devienne une référence dans le domaine de la super-résolution en relevant le défi scientifique et industriel de réaliser un système d’imagerie cellulaire en volume à l’échelle moléculaire.