Mécanisme et régulation de la dissociation des cohésines de l'ADN – FineTuneCohesion

The Rad21 subunit of cohesin was found hyperphosphorylated in PP4 ablated cells. Co-immunoprecipitation experiments were used to ask whether PP4 would contact cohesin and quantitative Mass spectrometry analysis was performed to identify candidate Rad21 residus. Finally a combinatorial rad21 phosphomutant library was screened to identify Rad21 residues which when mutated to phospho-mimic recapitulate the phenotype of PP4 ablated cells.

We identified two key serine residues within Rad21 which when phosphorylated shelter cohesin from Wpl1 anti-cohesion activity and protection is reversed by Protein Phosphatase 4.
Quantitative mass spectrometry indicated that two clusters of serine residues were more frequently phosphorylated in the absence of PP4. A combinatorial rad21-phosphomutant library was constructed and screened for rad21 alleles that would suppress the thermosensitive defect of an eso1ts mutant. Mutated sequences were integrated at the rad21 locus to generate rad21 phospho-alleles. This strategy identified two serine residues within Rad21 central region that when mutated to E (phosphomimic) damped Wpl1 anti-cohesion function as shown by genetics and FISH analysis of sister-chromatid cohesion. Importantly, the double alanine substitution compromised the suppression mediated by PP4 ablation, consistent with PP4 acting through the de-phosphorylation of these two Rad21 residues.

Defects in cohesin functions in human can lead to severe pathologies such as Down syndrome, developmental defects and cancer. As mentioned above, we have now good evidence that the phosphorylation status of the Rad21 kleisin subunit of cohesin modulates the anti-cohesion function of Wpl1. The important implication is that sister-chromatid cohesion may be fine-tuned in space and time by altering the balance between kinase and phosphatase activities. Future experiments will aim at identiftying the kinase(s) that phosphorylate Rad21. Another important issue is understanding the mechanism by which Rad21 phosphorylation shelters cohesin from Wpl1 activity.

A second Wpl1 anti-cohesion pathway requires dephosphorylation of fission yeast kleisin Rad21 by PP4. Birot A, Eguienta K, Vazquez S, Claverol S, Bonneu M, Ekwall K, Javerzat JP, Vaur S.. EMBO J. 2017 May 15;36(10):1364-1378.

La cohésine est un complexe protéique en forme d'anneau capable de capturer les molécules d'ADN. L’anneau a un diamètre voisin de 50nm et il est formé par les protéines Smc1, Smc3 et Scc1 (appelée aussi Rad21). La capture de l’ADN nécessite l’ouverture de l’anneau au niveau de l’interface Smc1-Smc3 (la porte d’entrée). Réciproquement, l’ADN peut s’échapper de l’anneau via l’ouverture de l’interface Rad21-Smc3 (la porte de sortie). Il en résulte que le temps pendant lequel l’ADN est capturé est déterminé par l’équilibre entre les réactions de capture et d’échappement de l’ADN.
Les cohésines participent à de nombreux processus cellulaires et il est anticipé que la régulation passe au moins en partie par le contrôle des cycles de capture-échappement. Prévenir l’échappement de l’ADN est en effet crucial pour la cohésion des chromatides sœurs qui doit persister depuis la réplication de l’ADN jusqu’au moment de la division nucléaire, un intervalle de temps de l’ordre de quelques heures dans les cellules somatiques à plusieurs dizaines d’années pour les ovocytes humains ! La cohésion peut aussi être renforcée en réponse à une cassure double-brin de l’ADN ou encore promouvoir la formation de boucles intra-chromosomiques ayant pour effet d’organiser l’architecture nucléaire et la régulation transcriptionnelle de l’expression génique (contacts enhancer-promoter, domaines chromatiniens et isolateurs transcriptionnels).
La fonction de capture de l’ADN par les cohésines est ainsi centrale à de nombreux processus cellulaires ce qui souligne l’importance de comprendre sa régulation. L’échappement de l’ADN est stimulé par la protéine Wapl et la réaction est bloquée lorsque les protéines Smc3 et Rad21 sont artificiellement liées de façon covalente, suggérant fortement que l’interface Smc3-Rad21 est la porte de sortie et que Wapl est l’outil moléculaire qui promeut son ouverture. La question clé – et qui fait l’objet de ce projet - est de comprendre comment Wapl promeut l’ouverture de la « porte de sortie ».
Wapl contacte le complexe cohésine en plusieurs sites et notamment au niveau de l’interface Smc3-Rad21. Les interactions Wapl-cohésine peuvent être reconstituées in vitro mais pas l’ouverture de l’interface Smc3-Rad21, ce qui suggère l’existence d’un (ou plusieurs) effecteur en aval de Wapl qui porterait l’activité nécessaire à l’ouverture.
Nos résultats récents suggèrent que nous avons identifié une telle activité. Un crible génétique chez la levure Schizosaccharomyces pombe a identifié un nouvel acteur codant une phosphatase conservée de la levure à l’espèce humaine. Nos données suggèrent un modèle de travail dans lequel la phosphatase contacte le complexe cohésine et promeut l’ouverture de la porte de sortie de façon dépendante de Wapl et de la déphosphorylation de Rad21. Le projet vise à valider ce modèle et décrypter les mécanismes moléculaires sous-jacents. Une approche pan-génomique sera utilisée pour caractériser les conséquences fonctionnelles de ce mode de régulation à l’échelle du génome.
Compte-tenu de la conservation des facteurs concernés, il est attendu que les connaissances générées soient de portée générale. La grande variété des fonctions contrôlées par les cohésines – et les pathologies humaines correspondantes – soulignent la nécessité de connaissances fondamentales solides dans ce domaine. Nos données ouvrent une nouvelle voie de recherche dans ce domaine très compétitif. Un soutien financier à ce stade est crucial pour nous permettre de concrétiser l’avance conceptuelle que nous procurent ces nouvelles connaissances.