Aspects évolutifs et fonctionnels du génome non-codant : le paradigme de l'inactivation du chromosome X – NoncodiX

Nous analysons l’inactivation du X en combinant plusieurs approches, à la fois globales (RNA-seq, ChIP-seq) et à l’échelle de la cellule unique par RNA-FISH.
Nous développons également des approches fonctionnelles en utilisant des approches d’interférence à ARN (knock-down) et des techniques de manipulation du génome (CRISPR) pour créer des mutations de régulateurs candidats. Nous étudions ensuite l’impact de ces mutations sur l’inactivation du X et sur l’organisation tridimensionnelle du chromosome, analysée par des approches de capture de conformation chromosomique.

- Nous avons identifié Ftx comme nouveau régulateur de l’inactivation du X chez la souris agissant en cis.
- Nous avons montré que la fonction de l’ARN non-codant Jpx semble conservée chez l’homme.
- Nous avons identifié Linx comme nouveau régulateur en cis du locux Xist affectant l’inactivation aléatoire.
- Nous avons précisé la region de l’ARN Xist impliquée dans le recrutement de PRC2 au X inactif.
- En combinant des études in vivo à des approches de transgénèse chez la souris, nous avons montré que l’ARN non-codant XACT entre en compétition avec XIST pour contrôler l’activité des chromosomes X pendant le développement précoce humain.
- Nous avons également montré que l’état pre-inactif (naïf) chez l’humain est défini, in vivo et in vitro, par la présence de chromosomes X actifs recouverts par les ARN XIST et XACT.

Ce projet ambitieux permettra d’une part d’accroitre nos connaissances des lncRNAs, dans le contexte de l’inactivation du X et plus généralement dans le contrôle des programmes d’expression génique et de l’organisation nucléaire. Il apportera également des données originales sur la régulation de l’inactivation du X chez l’humain, pour lequel les connaissances actuelles sont presque inexistantes. Cette étude nous permettra enfin de mieux comprendre comment les ARNnc contribuent à promouvoir la diversité au cours de l’évolution.

Vallot C., Patrat C., Huret C., Collier A., Casanova M., Liyakat Ali T., Tosolini M., Frydman N., Heard E., Rugg-Gunn P. and Rougeulle C. Competing action of XIST and XACT non-coding RNAs in the control of X chromosome activity during human early development. Cell Stem Cell. In revision.

Furlan G. and Rougeulle C. (2016) Function and evolution of the long non-coding RNA circuitry orchestrating X chromosome inactivation in mammals. Wiley Interdiscip Rev RNA. May 13. doi: 10.1002/wrna.1359. [Epub ahead of print]

Da Rocha and Heard (submitted) Novel players in X-inactivation – mechanistic insights into Xist RNA-mediated silencing and chromosome conformation. Nature Structural and Molecular Biology.

Les longs ARNs non-codants (lncRNAs) sont maintenant des acteurs reconnus de nombreux processus cellulaires allant de la régulation transcriptionnelle à la formation et l’intégrité des compartiments cellulaires. Il est néanmoins important de réaliser que les études fonctionnelles ne concernent pour l’instant qu’une fraction mineure de ces transcrits et qu’on est loin de mesurer l’étendue de leurs fonctions. De plus, la plupart des études sont menées dans des modèles cellulaires animaux, en particulier murin. Les lncRNAs sont pourtant peu conservés et on ne sait pas à l’heure actuelle dans quelle mesure des transcrits pourraient avoir des rôles identiques dans différentes espèces ou au contraire contribuer à faciliter l’évolution et participer aux spécificités d’espèces. Nous proposons dans ce projet d’étudier ces questions dans le cadre de l’inactivation du chromosome X. Ce processus fait en effet intervenir de nombreux lncRNAs dont certaines fonctions n’ont été jusqu’à présent qu’étudiées chez la souris. Nous avons cependant montré qu’il existe des divergences notoires au niveau des stratégies d’inactivation du X entre espèces, notamment entre la souris et l’homme, et nous postulons que des lncRNAs pourraient constituer les bases moléculaires de ces divergences. Nous proposons donc l’étude fonctionnelle de plusieurs lncRNAs candidats, dont certains sont conservés entre espèces et d’autre non. Ces études seront essentiellement menées dans le contexte de cellules souches embryonnaires humaines et murines, qui représentent un stade critique ou l’inactivation du X subit des régulations importantes. Nous inclurons également un modèle de souris mutantes pour un lncRNA d’intérêt que nous avons généré, et qui représente un des rares modèles animaux permettant d’appréhender la fonction d’un lncRNA in vivo. Nous intégrerons à ces études une cartographie multi-espèces de l’épigénome et des interactions 3D au niveau de la région contrôlant l’inactivation, dans des contextes sauvages et mutants pour nos lncRNAs d’intérêt. Cette analyse permettra d’une part l’identification systématique de nouveaux éléments régulateurs du processus et d’autre part de déterminer dans quelle mesure les lncRNAs contribuent à cette organisation. Nous prendrons avantage des avancées récentes au niveau des outils de manipulation des génomes, qui permettent d’augmenter la vitesse et l’efficacité avec lesquelles des mutations peuvent être générée et que chaque partenaire maitrise.
Ce projet ambitieux permettra d’une part d’accroitre nos connaissances des lncRNAs, dans le contexte de l’inactivation du X et plus généralement dans le contrôle des programmes d’expression génique et de l’organisation nucléaire. Il apportera également des données originales sur la régulation de l’inactivation du X chez l’humain, pour lequel les connaissances actuelles sont presque inexistantes. Cette étude nous permettra enfin de mieux comprendre comment les ARNnc contribuent à promouvoir la diversité au cours de l’évolution.