Mécanismes moléculaires et impact de la voie de dégradation des ARNm nonsense (NMD) sur le transcriptome eucaryote. – CLEANMD

Spectrométrie de masse quantitative.
Analyses sur molécules uniques à l'aide de «pinces magnétiques«

Des purifications par affinité ont tout d’abord été réalisées avec des facteurs connus du NMD chez la levure (Upf1, Upf2, Upf3) et analysées par spectrométrie de masse quantitative (LFQ). Des purifications « de rebond » ont été effectuées avec les nouveaux facteurs identifiés. Au total, 94 purifications ont été analysées à ce jour. De manière remarquable et inattendue, ce travail a révélé que le facteur Upf1 est associé à deux complexes mutuellement exclusifs. Nos résultats suggèrent que ces deux complexes reflètent deux étapes successives du processus, l’étape de reconnaissance des substrats (premier complexe) et l’étape de dégradation (deuxième complexe).

Les analyses sur molécules uniques ont été réalisées par les partenaires 2 et 3. Le travail sur la molécule Upf1 humaine a été finalisé et publié dans Nature communications en 2015. La surprise de cette analyse a été l’exceptionnelle processivité de cette hélicase. L’analyse de l’orthologue de levure est maintenant bien avancée. Elle révèle une même processivité remarquable alors que l’enzyme de levure est 10 à 20 fois plus rapide que l’enzyme humaine. Nous avons également analysé l’ARN hélicase humaine Ighmbp2, membre de la sous-famille d’Upf1. Bien que très proche d’Upf1 en séquence, cette enzyme se révèle très peu processive démontrant l’aspect singulier de l’exceptionnelle processivité d’Upf1.

Analyser le rôle du NMD dans l’élimination d’ARNm aberrants générés par un défaut de spécificité de l’initiation de la transcription par l’ARN polymérase PolII : Le partenaire 1 a finalisé les travaux sur la levure. Les résultats ont été publiés dans eLife en 2015.

En ce qui concerne l'analyse des complexe, nous souhaitons poursuivre dans deux directions : i) Analyser à laquelle de ces deux étapes certains mutants sont affectés ; ii) Etendre l’analyse à l’homme. Une lignée cellulaire à était construite (partenaire 2) dans laquelle Upf1 est étiquetée.

Les premières expériences de CLIP (CRAC dans la levure) ont été mises en œuvre par le partenaire 1. Nous avons dû développer une méthode originale afin de générer des contrôles internes permettant une analyse plus quantitative des résultats. Les premières analyses sont très encourageantes.

En ce qui concerne les analyses en molécules uniques : Basé sur la structure de chacune de ces enzymes, nous envisageons de construire des mutants affectant la processivité d’Upf1 afin de déterminer son importance pour le processus de NMD.

Le partenaire 1 a par ailleurs identifié une hélicase putative interagissant avec des facteurs du NSD (Non Stop mRNA decay) et du NGD (No-Go mRNA decay). Ce facteur est associé aux ARNm en traduction, comme Upf1. Il serait intéressant d’analyser l’activité hélicase de cette enzyme potentiellement liée, comme Upf1, à des mécanismes de contrôle de qualité.

1. Fiorini F, Bagchi D, Le Hir H*, Croquette V*. (2015) Human Upf1 is a highly processive RNA helicase and translocase with RNP remodelling activities. Nature Communications. 6:7581
(doi: 10.1038/ncomms8581).

2. Malabat C, Feuerbach F, Ma L, Saveanu C, Jacquier A. (2015) Quality control of transcription start site selection by nonsense-mediated-mRNA decay. Elife Apr 23;4
(doi: 10.7554/eLife.06722).

Différents mécanismes contrôlent la capacité des ARNm à être correctement traduits. Le “Nonsense mRNA Mediated Decay” (NMD) est un mécanisme qui dégrade les ARNm comportant des codons STOP prématurés (PTC, pour "premature termination codons"). Le NMD constitue une cible thérapeutique intéressante. En effet, il a été estimé que les mutations nonsense, qui introduisent des PTC dans les ARNm, sont présentes dans près de 11% des maladies héréditaires chez l’homme. Bien que les mécanismes fondamentaux du NMD demeurent inconnus, des médicaments ont pu être isolés qui contrecarrent les effets délétères de ces mutations en inhibant le NMD et en permettant une translecture partielle des PTC.
Malgré des différences entre espèces, les acteurs principaux de ce processus, Upf1, 2, 3 et la machinerie de traduction, sont très conservés. Il est donc probable que les mécanismes fondamentaux du NMD soient similaires de la levure aux métazoaires. Deux questions clés restent non résolues : comment un PTC est-il reconnu et par quels mécanismes la reconnaissance d’un PTC déclenche la dégradation de l’ARN ? Enfin, l’effet du NMD sur les transcriptomes des eucaryotes n’a été que très partiellement étudié. Des avancées récentes obtenues dans chacun de nos laboratoires permettent de proposer de nouvelles hypothèses et méthodes pour aborder ces questions.
Selon les modèles actuels, les ARN sont reconnus comme substrats du NMD quand un PTC est suivi d’un long 3’-UTR auquel Upf1 se fixe. De plus, chez les métazoaires, la présence, en aval d’un PTC, d’un "exon-junction complex se lequel Upf1 peut-être recruté, déclenche le NMD. Nous avons récemment montré que chez la levure, les ANRm avec de longues ORF sont relativement insensible au NMD, même en présence d’un long 3’-UTR portant Upf1 (Decourty et al., 2014). Cette observation, inexpliquée par les modèles actuels, suggère de nouvelles hypothèses que nous voulons étudier dans le cadre de ce projet. Nous proposons en particulier de développer des méthodes permettant d’identifier les facteurs spécifiquement associés aux ribosomes engagés dans le NMD aux PTC ainsi que d’identifier de manière exhaustive les facteurs interagissant avec Upf1 de levure (yUpf1). Ces analyses bénéficierons des progrès récents permettant des analyses en spectrométrie de masse à la fois très sensibles et quantitatives.
Upf1 possède une activité hélicase essentielle pour le NMD. En combinant des analyses biochimiques et sur molécules uniques, nous avons établi que Upf1 humaine (hUpf1) est une translocase hautement processive (manuscrit en préparation), dont l’activité est régulée par son interaction avec Upf2 et potentiellement d’autres facteurs. Upf1 pourrait utiliser ces propriétés pour remodeler les mRNPs portant un PTC et déclencher la dégradation de l’ARN. Nous voulons valider et étendre ces observations chez la levure. En l’absence de test in vitro du NMD, cette approche sur molécule unique constituera une opportunité unique d’analyser le rôle des facteurs interagissant avec yUpf1 dans la modulation de son activité.
La découverte que le NMD chez la levure est principalement efficace sur les ARN portant de petites ORF coïncide avec la découverte que les substrats naturel du NMD chez cet organisme sont beaucoup plus abondants qu’estimé auparavant. Cette population de transcrits éliminés par le NMD résulte de la faible spécificité de l’initiation de la transcription (manuscrit soumis). Nous voulons étendre aux cellules humaines cette analyse, rendue possible par la mise au point d’une technique très sensible et spécifique de cartographie des sites d’initiation de la transcription.
En combinant les expertises extrêmement complémentaires de nos trois laboratoires, nous proposons ainsi une approche très intégrée pour étudier les mécanismes fondamentaux du NMD, conservés de la levure à l’homme, par des analyses allant de l’échelle génomique aux molécules uniques.