Fonction de la chromatine dans la réparation des DSBs. – DIvA

Nous avons récemment développé un système, basé sur l'expression d'une enzyme de restriction (AsiSI) fusionnée au domaine de liaison au ligand du récepteur aux oestrogènes, qui permet de générer de nombreuses DSBs, séquence-spécifique, parfaitement annotées sur le génome (Iacovoni et al, 2010; Massip et al, 2010). Ce système donne l'opportunité unique d'étudier à un niveau moléculaire, les modifications de la chromatine, et les mécanismes de réparation qui surviennent à différents endroits du génome, et donc dans différents contextes chromatiniens. De plus nous avons récemment amélioré ce système afin d'être en mesure d'arrêter l'activité de l'enzyme de façon contrôlée, et donc de stopper l'induction des DSBs: nous pouvons ainsi étudier les évènements qui prennent place après la réparation à proprement parler.

Afin de caractériser de façon exhaustive le paysage chromatinien induit autour des DSB nous avons dans un premier temps établit la cartographie de gammaH2AX et du complexe des cohesines après induction des DSB dans les cellules DIvA (Caron et al, 2012; Iacovoni et al, 2010; Massip et al, 2010). Nous avons ensuite étudié la fonction de ATM et DNAPK, deux kinases impliquées dans la réponse aux dommages, dans l’établissement des domaines gammaH2AX. A l’aide du système DIvA combiné à des approches genome wide et de microscopie avancée, nous avons découvert que ces deux kinases présentent des fonctions distinctes au cours de la réparation des DSBs (Caron et al, 2015). Enfin, nous avons montré que les DSB induits dans des gènes actifs sont réparés préférentiellement par recombinaison homologue, de façon dépendante de H3K36me3, une marque d’histone associée à la transcription (Aymard et al, 2014).

Nous voulons à présent : (i) comprendre la contribution de la chromatine pré-existante dans le choix de la voie de réparation (ii) décrire le paysage chromatinien induit autour des DSBs et sa fonction au cours de la réparation et (iii) élucider les processus qui permettent de rétablir la chromatine initiale après la réparation afin de maintenir l'information epigénétique.

Caron P, Choudjaye J, Clouaire T, Bugler B, Daburon V, Aguirrebengoa M, Mangeat T, Iacovoni JS, Álvarez-Quilón A, Cortés-Ledesma F, Legube G.Non-redundant Functions of ATM and DNA-PKcs in Response to DNA Double-Strand Breaks.Cell Reports. 2015 Nov 24;13(8):1598-609.

La maintenance de l'intégrité du génome est d'une importance capitale chez les organismes multicellulaires, comme cela est illustré par l'existence de nombreuses pathologies humaines associées à des défauts de la réparation de l'ADN. Parmi les dommages à l'ADN, les lésions double brins (DSBs) représentent le danger le plus important pour la cellule, puisqu’elles peuvent conduire à des réarrangements chromosomiques. Les DSBs sont prises en charge principalement par deux voies de réparation, la Recombinaison Homologue (HR) et Jonction d'Extrémité Non Homologue (NHEJ), qui sont toutes deux essentielles à la survie.
Au cours des dernières années, il est devenu évident que la chromatine, qui compacte l'ADN, est le véritable substrat de tous les processus impliquant l'ADN, et qu'elle joue ainsi un rôle critique dans la réparation de l'ADN.
La réparation dans le contexte de la chromatine soulève plusieurs questions, que nous nous proposons d'adresser ici.
Premièrement, de nombreuses évidences (nos travaux, (Aymard et al, 2014), ainsi que d'autres études (pour revue voir (Soria et al, 2012)) suggèrent que l'environnement chromatinien dans lequel survient une DSB pourrait influencer de façon majeure la voie de réparation utilisée. Puisque les différentes voies de réparation peuvent laisser sur le génome des "cicatrices" différentes, cet aspect de la réparation est absolument fondamental, et des études complémentaires sont requises pour vraiment élucider comment la structure de la chromatine régule le choix de la voie de réparation. Deuxièmement, de nombreuses modifications d'histones ont été récemment montrées comme induites aux DSBs, mais l'image complète du paysage chromatinien induit autour des DSB n'est pas encore caractérisée. Plus précisément, les modifications associées à chacune des voies de réparation ("code des histone de réparation") sont tout à fait inconnues.
Enfin, après la réparation, il est important que la chromatine initiale soit rétablie, de façon à maintenir l'information epigénétique et donc le destin cellulaire. Jusqu'à présent l'absence d'un système permettant d'induire des DSBs à des endroits connus du génome a empêché ce type d'étude.

Nous avons récemment développé un système, basé sur l'expression d'une enzyme de restriction (AsiSI) fusionnée au domaine de liaison au ligand du récepteur aux oestrogènes, qui permet de générer de nombreuses DSBs, séquence-spécifique, parfaitement annotées sur le génome (Iacovoni et al, 2010; Massip et al, 2010). Ce système donne l'opportunité unique d'étudier à un niveau moléculaire, les modifications de la chromatine, et les mécanismes de réparation qui surviennent à différents endroits du génome, et donc dans différents contextes chromatiniens. De plus nous avons récemment amélioré ce système afin d'être en mesure d'arrêter l'activité de l'enzyme de façon contrôlée, et donc de stopper l'induction des DSBs (Aymard et al, 2014): nous pouvons ainsi étudier les évènements qui prennent place après la réparation à proprement parler.

Avec de tels outils en main, nous proposons d'étudier plusieurs aspects du rôle de la chromatine dans la réparation des DSBs:
Grace à des techniques haut débit (génomique et protéomique) nous voulons (i) comprendre la contribution de la chromatine pré-existante dans le choix de la voie de réparation (PRIME) (ii) décrire le paysage chromatinien induit autour des DSBs et sa fonction au cours de la réparation (REPAIR) et (iii) élucider les processus qui permettent de rétablir la chromatine initiale après la réparation afin de maintenir l'intégrité de l'information epigénétique (RESTORE).