Assemblage et ultrastructure des septines, de la molécule à la cellule – SEPTIME
SEPTIME
Assemblage et ultrastructure des septines
Assemblage et ultrastructure des septines
The present project was divided into three main tasks. <br />The first one aims at characterizing the role of septin in membrane deformation and reorganization. To assess whether the observed phenotype are conserved, both budding yeast and fly septins are used. We have proposed, first, to analyze the ultrastructure of fly septins (task 2A). The organization of septin filaments or rods onto biomimetic membranous systems (task 2B), as well as the membrane deformation induced by the septin lipid interaction (task 2C) are being probed. Besides, we have proposed to analyze the local membrane reorganization after septin- lipid binding (task 2.D).<br />The second main task focuses on the role of septins in membrane dynamics. We have proposed to analyze the assembly of septins in real time both in solution and on lipidic biomimetic systems (task 3A). Besides that, we aim at testing the direct role of septins for restricting the diffusion of membrane protein (task 3B).<br />The last task aims at analyzing the organization of septins in situ. First, we have proposed to use genetically labeled septins in situ visualizable by electron microscopy (task 4.A). The organization of septins in budding yeast (task 4.B) and within drosophila embryos (task 4.C) will be investigated.
The biological samples are expressed and purified from either E.coli or insect cells in their wild type ot mutant versions.
The organization of septins in solution and on biomimetic systems is analyzed by cryo-electron microscopy and fluorescence microscopy.
AFM is being used to study the re-organization of lipid domains following their interaction with septins.
To investigate the organization of septins in situ we are using a combination of correlative microscopy and super resolution microscopies.
More precisely, we have analyzed the ultra-structural organization of Drosophila septins in different ionic conditions for both wild type and a set of chosen mutants. Drosophila septins assemble into symmetric rods or filamentous bundles.
Besides, the design of mutants has demonstrated that coiled coils C termini, basic residues at the N termini of septin subunits are essential for the formation of filamentous structures.
Tasks 2B and 2C
We have optimized the lipid composition which facilitates septin-membrane interaction by using lipid monolayers. The use of synthetic PIP2 (18:1) seems to facilitate and make the membrane-protein interaction more reproducible. Septins assemble onto biomimetic membranes into filaments or arrays of filaments. Besides they deform vesicles by flattening them and inducing protusion-like features. We have performed cryo-tomography to characterize both the vesicle deformations and the organization of the filaments onto membranes. A library of possible features (membrane deformation vs septin organization) has been established. Remarkably Drosophila septins can be visualized on lipid bilayers or monolayers as single or paired filaments, which can not be observed in solution.
The re-organization of lipid domains by the presence of septins is being assessed using AFM and high speed AFM on bilayers mixing fluid and rigid lipid domains. We are analyzing the segregation of septins within those domains most likely induced by the PIP2 localization within the domains.
Visualization of septins filament polymerization is preformed by high speed AFM and TIRF microscopy. Septins seem to assemble by both ends in a non-polar fashion.
To test the role of septins as direct barriers for membrane proteins we are reconstituting complex systems where septins are inside vesicles where transmembrane proteins are inserted.
The study of septins in situ (task 4) has been delayed and is being currently started.
Drosophila septins organize into symmetric rods and self assemble into bundles without forming individual filament.
In the presence of biomimetic membranes, containing PIP2, the septin lipid interaction competes with the septin – septin interaction. Thereby individual filaments can be visualized bound to membranes.
Septin filaments strongly deform, flatten and facet membranes.
Septins seem to assemble by both ends in a non-polar fashion.
The results from task 2A are under preparation for a manuscript.
We are now finalizing the experiments form tasks 2B-D to write a paper.
To test the role of septins as direct barriers for membrane proteins we are reconstituting complex systems where septins are inside vesicles where transmembrane proteins are inserted.
The study of septins in situ (task 4) has been delayed and is being currently started. Only preliminary studies have been performed by 3D super resolution microscopy and correlative microscopy (optical and electron microscopy).
revues à comités de lecture
1. Mavrakis M, Azou-Gros Y, Tsai FC, Alvarado J, Bertin A, Iv F, Kress A, Brasselet S, Koenderink GH, Lecuit T, Septins cross-link, bundle and bend actin,2014, Nat Cell Biol., 16 (4), 322-334
2. Tsai FC, Alvarado J., Koenderink G., Mavrakis, M, Bertin A.,Recombinant Drosophila septins organize into symmetric rods or filamentous bundles, in preparation.
3. Tsai FC, Alvarado J., Bertin, A., Koenderink, GH, Mavrakis, M., Characterization of actin-septin bundle: structure and dynamics, in preparation
Chapitres d'ouvrage
1. Bertin A. and Nogales E., Characterization of Septin –strastructure in Budding Yeast Using Electron Tomography, Methods in Molecular Biology, yeast cytokinesis, in Press
2. Bertin, A and Nogales E., Preparing recombinant septins and their analysis by electron microscopy Methods in cell Biology, Septins, in preparation
Les septines sont des protéines du cytosquelette qui forment des filaments au niveau de la membrane plasmique interne. Elles ont été découvertes chez la levure S. cerevisiae et jouent un rôle primordial dans la cytokinèse, dernière étape de la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, les septines sont essentielles à plusieurs étapes impliquant les remodelages membranaires comme la compartimentation cellulaire. Leur disfonctionnement est associé à la tumorigenèse et aux maladies neurodégénératives, Parkinson et Alzheimer. J’ai précédemment décrit par microscopie électronique (ME) l’organisation moléculaire et l’architecture 3D à résolution nanométrique des septines de levure in vitro et in situ. Le complexe formé des 4 sous-unités constitutives s’organise en un bâtonnet octamérique et symétrique. En fonction des sous-unités impliquées, les septines s’assemblent ensuite en filaments non polaires, réseaux ou anneaux. Les systèmes biomimétiques lipidiques ont été des outils clés pour démontrer que l’organisation supramoléculaire des septines était dirigée par des interactions spécifiques avec le lipide PI(4,5) P2. In vivo, les septines s’organisent en un réseau orthogonal de filaments, proches de la membrane plasmique interne.
Notre principal objectif consiste à mettre en évidence et comprendre les facteurs universels qui sont nécessaires à l’assemblage et à l’ultrastructure des septines et qui, par conséquent, dirigent leur fonction. Pour ce faire, deux modèles seront utilisés : les levures S. cerevisiae bourgeonnantes et drosophila melanogaster. Chez Drosophila, les septines interviennent lors de l’embryogénèse au cours de l’étape de cellularisation pendant laquelle les premières cellules sont formées au pourtour de l’embryon par l’invagination de la membrane embryonnaire de part et d’autre des noyaux. Les septines de drosophile diffèrent des septines de levure en nombres et composition protéique, leur organisation n’est pas connue et nos premiers résultats révèlent que leur architecture supramoléculaire diffère de celle de levure.
Nous avons trois objectifs :
- Comprendre le rôle des septines dans le remodelage des membranes et la réorganisation de domaines lipidiques. Cette partie implique la description complète de l’ultrastructure des septines de drosophile. Nous voulons aussi corréler la formation d’architectures diverses aux changements morphologiques de membrane de systèmes modèles représentatifs des différents états du remodelage membranaire.
- Analyser la dynamique en temps réel de l’assemblage des septines à la membrane et des conséquences sur la formation d’une barrière de diffusion de protéines membranaires.
- Décrire l’organisation 3D des septines dans un contexte cellulaire de levures bourgeonnantes mitotiques et d’embryons de drosophile en cellularisation pour en extraire les paramètres structuraux communs et spécifiques des fonctions des septines dans la cytokinèse et la cellularisation.
Des méthodes de pointe complémentaires seront mises en œuvre (cryo-ME, cryo-tomographie électronique, high-speed AFM, microscopie de fluorescence super-résolue) dans une étude multi-échelles de la molécule à la cellule.
Ce projet va bénéficier de la synergie des expertises d’A. Bertin de l’organisation et la dynamique des septines de levure et de son collaborateur de l’Institut Curie, D. Lévy qui possède l’expertise de l’analyse structurale de protéines transmembranaires par ME et le développement de systèmes lipidiques biomimétiques, ainsi que du Nikon Imaging Center de l’Institut Curie. Il va aussi bénéficier de collaborations externes (P.EM. Milhiet, Atomic Force microscopy, M. Mavrakis, septines de drosophile, G. Koenderink, biophysique des septines et partenaires). L’ensemble de ces études doit apporter une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes de formation de réseaux de septines responsable des réorganisations membranaires lors de processus de division
Coordination du projet
Aurélie BERTIN (INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenariat
INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE
Aide de l'ANR 249 924 euros
Début et durée du projet scientifique :
décembre 2013
- 42 Mois
