Implication de PARG dans la réparation, la réplication et la transcription – PIRRAT

L'absence d'inhibiteurs de PARG biodisponibles à ce jour, la présence de multiples isoformes et la létalité du «knockout« total de PARG complique l'étude du rôle de PARG in vivo. Nous avons initié la génération de nouveaux modèles cellulaires humains et de souris déficients en PARG endogène, par invalidation génétique ou par l'expression stable d'un shRNA et complémentation par des isoformes isolés ou des mutants de PARG, défectueux pour la liaison à des protéines partenaires, tels que PCNA. Ces modèles nous permettront d'explorer le rôle de chaque isoforme PARG et de leur interaction avec PCNA dans la réparation de l'ADN, la réplication de l'ADN et la transcription. Nous espérons que les expériences proposées permettront d'obtenir des connaissances nouvelles sur la fonction de PARG et de ses isoformes, encore peu étudiés, dans la réponse au stress réplicatif et aux dommages de l'ADN, dans la transcription et la différenciation cellulaire.

La Tâche 2 est presque achevée : nous avons montré que les cellules déficientes en PARG présentent une sensibilité accrue à l'hydroxyurée, un inhibiteur de la réplication, et que PARG n'est pas indispensable en cas de stress réplicatif transitoire, mais est nécessaire pour éviter la production massive de PAR, hautement délétère, lors d'un stress réplicatif prolongé, conditions menant à un effondrement de fourches de replication et à la formation de cassures double brin de l'ADN (DSB). L'accumulation de PAR altère l'association à l'ADN simple brin de la protéine RPA au niveau des fourches effondrées, ce qui compromet leur réparation par recombinaison homologue. Nos résultats mettent en évidence le rôle crucial de PARG pour contrôler finement le taux de PAR en réponse à un stress génotoxique, afin de prévenir des effets néfastes d'une sur-accumulation de PAR. Ces résultats ont été publiés: Illuzzi et al, 2014, Nucleic Acids Res, 42 , 7776-92 . Pour les Tâches 3 et 4, nous sommes sur le point d'obtenir les modèles cellulaires déficients en PARG endogène et complémentés par des isoformes et des mutants de PARG.

Notre projet apportera des connaissances fondamentales de premier ordre sur le rôle de PARG, encore trop peu documenté, dans les processus que sont la réparation, la réplication et la transcription. S’il existe 17 gènes PARP différents, il n’existe qu’un gène PARG, mais qui code pour plusieurs isoformes présentant des localisations subcellulaires diverses et dont le rôle relatif n’est pas encore bien connu. La suite de ce projet a pour but de caractériser le rôle de PARG et de la PARylation dans la réparation, la réplication et la transcription. Pour cela, nous générons actuellement un ensemble d’outils cellulaires originaux, humains et murins, basés sur l'invalidation génétique ou de l'expression de PARG endogène par shRNA, couplée à l'éventuelle complémentation par les isoformes de PARG ou des mutants affectés dans les domaines d'interaction de PARG avec PCNA.

PARG is dispensable for recovery from transient replicative stress but required to prevent detrimental accumulation of poly(ADP-ribose) upon prolonged replicative stress.
Illuzzi G, Fouquerel E, Amé JC, Noll A, Rehmet K, Nasheuer HP, Dantzer F and Schreiber V. (2014). Nucleic Acids Res. 42, 7776-92.

La poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) est une modification post-traductionelle de protéines médiée par les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs). Ces enzymes utilisent le NAD+ comme substrat et catalysent la synthèse d’un polymère branché d’ADP-ribose, le poly(ADP-ribose) (PAR), sur un ensemble de protéines acceptrices. La PARylation, en accélérant la réparation des cassures de l’ADN, a initialement été décrite comme un acte de survie dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN. Le taux de PAR cellulaire est régulé par les PARPs et par l’enzyme qui dégrade le PAR, la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG), contrôlant la balance vie-et-mort dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN. La PARylation, outre son rôle essentiel dans le maintien de la stabilité du génome, intervient dans de nombreux processus cellulaires tels que l’expression des gènes, l’organisation de la chromatine, la progression du cycle cellulaire ou encore la différenciation cellulaire. Le rôle de PARP-1 dans ces processus est largement documenté, contrairement à celui de PARG, bien moins étudié. S’il existe 17 gènes PARP différents, il n’existe qu’un gène PARG, mais qui code pour plusieurs isoformes présentant des localisations subcellulaires diverses : nucléaire, cytoplasmique et mitochondriale. Le rôle relatif de ces isoformes n’est pas encore connu. Ces multiples isoformes, ainsi que la létalité embryonnaire de la souris invalidée pour l’expression de toutes ces isoformes simultanément, compliquent considérablement l’étude de la fonction biologique et physiologique de la PARG. Par ailleurs, il apparaît que, bien qu’ayant des activités antagonistes dans le métabolisme du PAR, PARP-1 et PARG n’ont pas nécessairement des fonctions antagonistes dans la cellule. Il reste donc à élucider comment la PARG contribue à la régulation dynamique de la PARylation afin de contrôler finement les processus cellulaires qui impliquent cette modification post-traductionnelle.

Dans cet contexte, des avancées significatives ont déjà été obtenues par les partenaires de ce projet : le Partenaire 1 a montré que l’absence de PARG augmente la radio-sensibilité et affecte la réparation des cassures simple et double brin de l’ADN (Amé et al, 2009, J. Cell Sci. 122, 1990-2002). Le Partenaire 1 a également révélé un lien fonctionnel entre PARG et le facteur de réparation/réplication PCNA, montrant que cette interaction participe au recrutement de PARG au site d’ADN endommagé et aux foyers de réplication (Mortusewicz et al, 2011, Nucleic Acids Res. 39, 5045-56). Enfin, les Partenaires 1 et 2 ont récemment démontré le rôle crucial de PARG dans la transactivation des gènes médiée par le récepteur à l’acide rétinoïque (Le May et al, 2012, Mol Cell 48, 785-98).

Le projet proposé a pour but de caractériser le rôle de PARG et de la PARylation dans la réparation, la réplication et la transcription. Pour cela, les Partenaires 1 et 2 vont générer un ensemble d’outils cellulaires originaux, qui, combinés à leur expertise dans l’étude de la réparation de l’ADN, de la réplication et de la transcription, vont leur permettre de :
- déterminer le rôle de PARG dans la réponse cellulaire au stress réplicatif (Partenaire 1)
- déterminer le rôle de PARG dans la régulation de la transcription dans un modèle bien établi de re-programmation transcriptionnelle, qui opère lorsque les cellules ES de souris sont traitées par de l’acide rétinoïque pour être différenciées en neurones (Partenaire 2)
- caractériser l’interaction fonctionnelle entre PARG et PCNA et déterminer son implication éventuelle dans la réparation, la réplication ou la transcription (Partenaire 1).

Le projet proposé apportera des connaissances fondamentales sur le rôle de l’enzyme majeure de dégradation du PAR, la PARG, encore peu documentée, dans les processus que sont la réparation, la réplication et la transcription.