La régulation des divisions méiotiques de l’ovocyte : une approche in vivo du paradoxe des signalisations AMPc – OOCAMP

Notre approche repose sur l’identification chez le xénope et Clytia de protéines régulatrices en amont et en aval de l'AMPc.
En amont de l'AMPc : nous avons caractérisé l'hormone responsable de la reprise de la méiose chez Clytia, et identifié son récepteur ovocytaire par des approches de transcriptomique et des tests fonctionnels in vitro. Par la mutation dirigée des gènes (approche CRISPR-Cas9), nous avons testé le rôle du récepteur, ainsi que d’une protéine photoréceptrice clé identifiée dans les cellules qui produisent l'hormone.
En aval de l'AMPc : Nous avons découvert que la protéine ARPP19 est la cible de PKA dans l'ovocyte de xénope. Pour identifier cette protéine, sa régulation par phosphorylation et ses partenaires, nous utilisons des approches de biochimie (chromatographies, spectrométrie de masse), nous avons modifié ces molécules régulatrices par des techniques de biologie moléculaire, et microinjecté ces protéines dans les ovocytes des deux espèces pour tester leur fonction. Pour caractériser leurs effets dans les ovocytes injectés, avons utilisé des approches d'imagerie cellulaire par microscopie, de biologie moléculaire et de biochimie.

Chez la méduse, nous avons identifié l'hormone qui déclenche les divisions ovocytaires et son récepteur qui provoque la hausse de l'AMPc, ainsi que la photorécepteur qui régule la production de l'hormone. Nous montrons que la protéine ARPP19, phosphorylée par PKA, est responsable du maintien de l'état dormant des ovocytes de xénope, mais qu'une fois les divisions déclenchées, sous l’influence d’une autre enzyme, elle les stimule! Nos expériences croisées révélent que le rôle stimulateur d’ARPP19 est ancien dans l’évolution, alors que sa régulation par PKA évolue rapidement selon les espèces.

Le projet OOCAMP vise à comprendre les systèmes biochimiques qui connectent les signaux extracellulaires de maturation méiotique et l’activation du MPF. L’étude de ce processus physiologique continuera à enrichir les connaissances de la régulation hormonale de la reproduction, du cycle cellulaire, des voies de signalisation et des mécanismes de l’oncogenèse. Outre les impacts d'ordre cognitif, nos travaux ouvrent aussi des perspectives d'ordre biomédical : futures voies de recherche ou de diagnostic à explorer chez les mammifères, et notamment l'espèce humaine.

Nos résultats ont fait l'objet de 7 articles dans des revues internationales à comité de lecture. Quatre autres sont en cours de rédaction. Ils ont fait évoluer les concepts de la méiose et introduit de nouveaux paradigmes : passage de la notion de bascule à celle de rhéostat, utilisation de l'AMPc de façon divergente entre invertébrés et vertébrés. Cela nous a conduit à rédiger 2 articles de revues et chapitres d'ouvrage, à faire 7 communications dans des congrès internationaux, et à participer à 6 évènements grand public.

Les cellules se reproduisent grâce au cycle cellulaire, un processus qui assure la croissance et le développement des êtres vivants. C’est l’activation du MPF (M-phase Promoting Factor, ou complexe Cdk1-cycline B) qui déclenche la division cellulaire. La connaissance des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire est essentielle et a fasciné les biologistes depuis longtemps. Curieusement, malgré l’intérêt majeur suscité par ce processus, un manque criant de connaissances règne sur certaines étapes cruciales du cycle, en particulier le contrôle de la transition G2-M. Le projet OOCAMP a pour objectif d’améliorer nos connaissances de la transition G2-M par une approche physiologique basée sur l’utilisation des ovocytes d’un amphibien, le xénope, et d’un cnidaire, la méduse Clytia : deux modèles expérimentaux simples et puissants, caractérisés par des arrêts naturels dans le cycle cellulaire, débloqués par des stimuli externes définis capables d’induire la reprise du cycle cellulaire.
Lors de l’ovogenèse, les ovocytes entament la méiose et s’arrêtent en prophase de 1ère division méiotique (équivalent à une phase G2). Des signaux extracellulaires provoquent la reprise de la méiose en lançant des voies de transduction qui convergent vers l’activation du MPF. L’AMPc est le 1er effecteur impliqué en amont de ces voies, mais de manière surprenante il agit de manière opposée selon les espèces. Chez les vertébrés, la concentration en AMPc, et donc l’activité de la kinase PKA, sont maintenus à de hauts niveaux dans l’ovocyte bloqué en prophase, et doivent chuter pour permettre la reprise de la division méiotique (une situation analogue à celle du contrôle exercé par l’AMPc sur la transition G2-M du cycle mitotique). Au contraire, chez de nombreux invertébrés, comme Clytia, une augmentation d’AMPc et de l’activité PKA est requise pour permettre la sortie de l’arrêt en prophase. Nous avons pour objectif de comprendre la régulation exercée par l’AMPc en comparant et en interchangeant les régulateurs et les effecteurs du système AMPc dans deux modèles expérimentaux, le xénope et Clytia, chez lesquels l’AMPc joue un rôle opposé. Nous répondrons spécifiquement à deux questions : la nature du système moléculaire recevant le signal externe en amont de l’AMPc, et l’identification des substrats de PKA qui provoquent l’activation du MPF en aval de l’AMPc.
Notre approche repose sur des manipulations de biochimie et biologie moléculaire, couplées à des microinjections de protéines dans les ovocytes des deux espèces et au suivi des réponses physiologiques et moléculaires par microscopie et tests biochimiques. Nous nous focaliserons sur une protéine appelée ARPP19, dont nos données préliminaires chez le xénope indiquent qu’elle correspond au substrat critique de PKA responsable de l’arrêt en prophase des ovocytes de vertébrés. Une phosphorylation distincte d’ARPP19, catalysée par la kinase Greatwall (Gwl) transforme ARPP19 en un activateur du MPF, essentiel à l’entrée en division. Nous avons identifié l’homologue d’ARPP19 chez Clytia, qui possède les sites de phosphorylation par PKA et Gwl. Nous comparerons les fonctions des deux versions d’ARPP19. En parallèle, nous identifierons le récepteur du peptide qui est responsable de la reprise de la méiose chez Clytia par une nouvelle approche transcriptomique.
Les deux partenaires du projet OOCAMP, experts dans l’étude de la maturation méiotique, présentent une excellente complémentarité, à la fois sur le plan de leurs modèles animaux, de leurs approches techniques et de leurs expertises, ce qui assure la faisabilité du projet.
En conclusion, le projet OOCAMP vise à comprendre les systèmes biochimiques qui connectent les signaux extracellulaires de maturation méiotique et l’activation du MPF. L’étude de ce processus physiologique continuera à enrichir les connaissances de la régulation hormonale de la reproduction, du cycle cellulaire, des voies de signalisation et des mécanismes de l’oncogenèse.