Structure, fonction et dynamique du facteur de transcription TFIIH – TFIIH-Complexes

Chez l’homme, la régulation de l'expression de gènes et le maintien de l'intégrité du génome implique des complexes multi-protéiques. L'initiation de la transcription par l’ARN polymérase II nécessite la mobilisation et l’activité corrélée de plus de 40 protéines, parmi lesquelles les 10 sous-unités du facteur de transcription IIH (TFIIH). Ce facteur possède trois activités enzymatiques et est composé de deux sous-complexes: le core-TFIIH composé de 6 sous-unités dont l’hélicase XPB et le module kinase (CAK) comprenant la kinase CDK7. L’hélicase XPD relie le core-TFIIH et le CAK qui existe aussi sous forme complexe libre avec une fonction distincte. Bien qu'identifié comme un facteur d'initiation de la transcription, TFIIH est également impliqué dans la réparation par excision de nucléotides de l’ADN (NER), pour l’ouverture de la double hélice d’ADN au niveau d'une lésion et le recrutement des autres facteurs de réparation.

Bien que découvert il y a plus de deux décennies, les études structurales de TFIIH au niveau de son organisation supramoléculaire et de ses interactions avec ses autres partenaires sont encore limitées Ce projet a pour objectif de décrypter l’organisation supramoléculaire du facteur TFIIH en utilisant des méthodes biochimiques, biophysiques et structurales complémentaires ainsi que des techniques d'imagerie pour fournir des informations du niveau cellulaire jusqu’au niveau moléculaire. Notre projet se concentre sur les quatre objectifs suivants :

- Etude de l'architecture moléculaire de TFIIH. Par des combinaisons de méthodes de marquage (chimique et échange Hydrogène/Deuterium) couplé à la spectrométrie de masse, nous établirons une cartographie des interactions protéine-protéine dans le complexe TFIIH. Ces résultats nous permettrons d’optimiser des complexes binaires et ternaires à des fins d’études moléculaires par RMN et par diffraction aux rayons-X.

- Etude fine de la structure moléculaire de complexes impliquant TFIIH par des approches biophysiques en solution et par cryo-microscopie électronique. L’étude concernera plus particulièrement des complexes stables impliquant l’endonuclease XPG, qui participe avec TFIIH à la voie de réparation de l’ADN par excision re-synthèse et stabilise l’association entre core-TFIIH, CAK et XPD.

- Etude des interactions entre CAK, XPD et le core-TFIIH. En se basant sur la structure d'un homologue archébactérien, nous avons montré que le domaine ARCH de XPD est critique pour le recrutement du CAK. Une étude préliminaire d’une mutation unique dans XPD responsable de la maladie génétique rare, la Trichothyodystrophie nous a permis d’identifier le domaine ARCH comme un potentiel régulateur moléculaire de l’activité hélicase de XPD. L’étude de l’interface CAK/XPD par spectrométrie de masse et mutagenèse aléatoire permettra d’identifier les résidus essentiels pour l’interaction entre CAK et XPD. L’impact des mutations dans le domaine ARCH de XPD sera étudié par mesure de l’activité de TFIIH in vitro et in vivo.

- Etudes par des approches d’imagerie cellulaire permettront de comparer pour des complexes fonctionnels et mutants la distribution spatio-temporelle cellulaire de TFIIH, son recrutement au cours de l’activation de la transcription et de la réparation de l’ADN. Nous utiliserons en particulier des lignes cellulaires contenant un locus artificiel permettant de visualiser le recrutement des composants du TFIIH lors de l’activation de la transcription et ainsi que des approches en molécule unique permettant une mesure directe des temps d'immobilisation de TFIIH sur la chromatine.

Les travaux proposés dans le cadre de cette demande fourniront non seulement des données sur les mécanismes régulateurs de la transcription et de la réparation de l’ADN chez les eucaryotes, mais auront également des implications biomédicales.