Nouvelle approche dans la lutte contre la résistance aux antibiotiques: reconstruction d'une pompe d'efflux à trois composants – ASSEMBLY

Après plusieurs décennies de succès dans la lutte contre les infections bactériennes, nous devons faire face à une menace croissante: l'évolution accélérée du phénomène de résistance aux antibiotiques, et l'absence de découverte de nouvelles familles d'antibiotiques. Il est donc urgent de développer de nouvelles approches dans la lutte contre ce problème majeur de santé publique.
Les bactéries ont développé 4 mécanismes principaux de résistance: (i) l'inactivation ou modification des drogues, (ii) la modification de la cible, (iii) la modification des voies métaboliques et (iv) la réduction de l'accumulation du médicament par la sur-expression des mécanismes d'efflux. C’est ce dernier mécanisme que nous nous proposons de cibler.
P. aeruginosa est un pathogène opportuniste pour l'homme et une des principales causes d'infection acquise en milieu hospitalier. Cette bactérie est la troisième cause d'infection nosocomiale après E. coli et S. aureus. Douze systèmes de pompes à efflux génétiquement distincts ont été décrits chez P. aeruginosa parmi lesquels quatre ont été biochimiquement caractérisés. Chacun est composé de trois protéines, deux (la RND et la OMF) étant des protéines membranaires localisées dans les deux membranes opposées des bactéries gram-, et la troisième (MFP), périplasmique, étant ancrée dans la membrane interne. L'approche classique largement explorée pour la pompe à efflux TolC/AcrA/AcrB de E. coli, consiste à cibler la fonction de la protéine RND seule, mais sans réel succès jusqu'à présent. De plus en plus d'expériences montrent que l'efflux nécessite la formation de la pompe entière pour être efficace. Une alternative serait donc d’empêcher l’assemblage de cette pompe. C’est une approche originale qui n'a jamais été explorée jusqu'à présent, principalement en raison de la méconnaissance du mécanisme d’assemblage au niveau moléculaire.
Par conséquent, nous voulons caractériser les conditions de formation et les mécanismes d’action de ces pompes et décrire les différentes interfaces impliquées dans la formation des complexes. Ces informations seront d'une importance capitale pour le développement de futur «bloqueurs de complexes" empêchant les reconnaissances protéine/protéine et/ou rigidifiant les zones d’interaction empêchant leur adaptabilité structurale.
Ce projet est organisé en trois axes principaux résumés comme suit :
- Analyse in vitro et in vivo des différents complexes protéiques. Dans un premier temps, nous allons déterminer la stoechiométrie des différents partenaires protéiques pris deux par deux par différentes approches in vitro (BN-PAGE, FRAPP, cryo-EM ...) dans différents environnements de substitution membranaire, explorant différents pH. Puis, l'importance relative de ces trois protéines et leur séquence d'assemblage seront évaluées en utilisant les mêmes techniques, mais en ajoutant alternativement le troisième partenaire. Les conséquences des mutations éventuellement suggérées par l’approche in silico pour stabiliser l’édifice seront analysées par ces mêmes approches et par des expériences de complémentation in vivo.
- Analyse in silico des différents partenaires par "Normal Mode Analysis" et "coarse grain" pour caractériser leur dynamique intrinsèque. Ceci permettra de mettre en évidence l'importance de mouvements fonctionnels nécessaires à l’assemblage. Construction d'un modèle tripartite et description de l'interface entre chaque paire protéique afin de suggérer d’éventuelles mutations permettant de stabiliser la formation du complexe.
- Détermination de la structure de chaque protéine par cristallographie aux rayons X. Ces structures seront utilisées pour l’interprétation des images de la structure complète de l'édifice obtenues par cryo-microscopie électronique et tomographie.
Le but de ce projet est d'obtenir des informations cruciales sur l'assemblage et l'ouverture des pompes à efflux afin d'ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la lutte contre la résistance aux antibiotiques.