Dissection holographique des circuits neuronaux – NeurHolog

La lumière est l’outil du 21ème siècle. La microscopie photonique combinée aux indicateurs fonctionnels, aux composés « cagés » et plus récemment, à l’optogénétique permet d’exciter et d’inhiber l’activité neuronale et de sonder les réponses fonctionnelles, de population cellulaire définie au sein de réseaux neuronaux actifs, de manière non-invasive. Une telle révolution motive le développement de nouvelles méthodes optiques de photo-stimulation. Parmi celles-ci, celles reposant sur la modulation de front d’onde par des matrices à cristaux liquides a depuis peu été proposée pour générer de façon dynamique et précise des motifs d’excitation mono- et bi-photonique (1P et 2P) optiquement confinés. Ceci a été rendu possible en combinant l’holographie digitale, la méthode de contraste de phase généralisée pour contrôler la distribution de la lumière dans le plan et la méthode de focalisation temporelle pour contrôler son confinement axial dans le cas de l’excitation 2P. Le but de ce projet est d’améliorer et d’appliquer ces techniques émergeantes à l’étude des relations structure-fonction au sein des réseaux neuronaux actifs.Les objets d’étude sont deux ensembles neuronaux rythmiquement actifs (oscillateurs) comprenant chacun environ 500 neurones génétiquement identifiés et optiquement accessibles, fonctionnels chez l’embryon et qui composent le générateur central du rythme respiratoire (RRG). L’un de ces objets est l’oscillateur du complexe préBötzinger (oscillateur preBötC), le composant le mieux caractérisé du RRG qui entraîne la respiration. L’autre, est l’oscillateur embryonnaire parafacial (oscillateur e-pF) qui, couplé au preBötC, attire progressivement une attention comparable à ce dernier, en vertu de son rôle crucial dans la chémo-sensibilité au CO2 et de son dysfonctionnement associé au Syndrome Congénital d’Hypoventilation Centrale. Restent totalement inconnues les connectivités neuronales de ces oscillateurs supportant leurs functions. Nous souhaitons tester une hypothèse de structure des oscillateurs (adaptée à la nécessaire robustesse et à la flexibilité du rythme respiratoire) par laquelle leur fonction dépendrait d’un nombre très réduit des neurones qui les compose. En utilisant les patrons d’excitation 1P et 2P nous pourrons pour la première fois, stimuler de façon sélective et réversible, au sein des oscillateurs, un nombre défini (1,2..10) de neurones exprimant la ChannelRhodopsine-2 (ChR2) et imager les réponses cellulaires pour en déduire les « liens » unissant les « nœuds » définissant la structure du réseau neuronal. Les études de l’e-pF, une structure fine ne dépassant pas 100µm d’épaisseur à la surface du cerveau, et du preBötC composé de cellules réparties sur 450µm dans une préparation de tranche, représentent des défis optiques croissants en parfaite adéquation avec les développements techniques que nous souhaitons tester. Pour atteindre avec une grande résolution axiale des cellules profondes nous auront recours à une excitation 2P avec des impulsions laser amplifiées. De plus, la combinaison de modulation de front avec des méthodes avancées de focalisation à distance (Variable Group Velocity Dispersion ou l’interposition d’un miroir ajustable dans un plan distant) doit permettre la génération de patrons d’excitation, dans un plan fixe, tout en capturant les signaux optiques des réponses par imagerie calcique, dans des plans différents, et qui pourront être changés de manière itérative. Ceci doit en donnant accès à un plus grand nombre de cellules répondant à l’excitation de la cellule photo-stimulée permettre de reconstruire en volume des ensembles de cellules connectées. Ainsi, une méthode utile pour inspecter la topologie des réseaux neuronaux sera mise à la disposition de la communauté scientifique. Ce programme doit aussi pouvoir éclairer les liens toujours obscures qui lient l’identité génétique des neurones, l’assemblage des réseaux neuronaux et leur fonctions.