Implémentation de Peptides Cagés pour Bloquer l'Endocytose (ImPeCaBle) – CaPeBlE

L'interaction d'une cellule avec son environnement se produit par l’intermédiaire de sa membrane plasmique. Pour adapter la forme et la composition de leur membrane plasmique, et intégrer les éléments nutritifs et les facteurs de signalisation, les cellules eucaryotes utilisent l’endocytose, la formation de vésicules à partir de la membrane plasmique. L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est la forme la plus largement utilisée de l'endocytose. La dynamique et les mécanismes moléculaires de l’EDC, et son rôle dans un certain nombre de fonctions cellulaires, ont fait l'objet d'études approfondies. Un grand nombre de protéines et d’interactions impliquées dans ce processus ont été identifiés, mais la dynamique de ces interactions est largement inconnue. Notre équipe interdisciplinaire de biologistes et de chimistes va développer de nouveaux outils pour visualiser et interférer avec des interactions clés menant à la formation des vésicules recouvertes de clathrine (VRC).
Premièrement, nous développerons des peptides photoactivables, ou cagés, pour bloquer l'interaction entre le domaine riche en proline de la dynamine, une protéine essentielle de l’EDC, et le domain SH3 (Src Homology 3) de ses partenaires, comme l’amphiphysine. Ceci va nous permettre de bloquer l’EDC dans les cellules vivantes d'une façon contrôlée spatialement et temporellement, ce que nous testerons par des techniques de microscopie de fluorescence sur les cellules vivantes permettant de détecter la formation des VRC. Deuxièmement, nous construirons des couples de protéines d'endocytose fusionnées avec des protéines fluorescentes pour visualiser leur interaction par imagerie de Förster Resonance Energy Transfer-Fluorescence Lifetime Microsopy (FRET-FLIM) dans des cellules vivantes. Nous ferons le parallèle entre ces interactions et les étapes de la création des vésicules d'endocytose. Cet ensemble d'expériences fourniront un niveau de détail sans précédent sur la dynamique des mécanismes moléculaires de l’EDC.
De plus, les peptides cagés développés dans ce projet seront utilisables dans de nombreux contextes cellulaires. En particulier, l’EDC est essentielle pour l'expression de la dépression synaptique à long terme (DLT), un substrat neuronal de certaines formes d'apprentissage et de mémoire. Nous allons effectuer des expériences d'électrophysiologie de patch clamp pour déterminer avec le peptide cagé où et quand l’EDC est nécessaire pour la DLT, et si l'endocytose contribue à la spécificité synaptique de la DLT. Nous prévoyons que ces outils, une fois mis à la disposition de la communauté scientifique, permettront de clarifier la participation de l’EDC dans de nombreuses fonctions cellulaires.