Distribution intra-cellulaire du fer chez les plantes, spéciation chimique et nouvelles fonctions – SUBCELIF

Homéostasie du fer dans le chloroplaste :
Pour mieux comprendre comment le fer est transporté dans le chloroplaste et comment li est incorporé aux métalloprotéines, nous avons analysé le contenu en métaux ainsi que l’abondance de différentes métalloprotéines chloroplastiques. Pour cela, des chloroplastes ont été isolés par centrifugations différentielles. Les métaux ont été dosés avec un spectroscope atomique d’émission à plasma micro-ondes (MP-AES), les protéines ont été quantifiées par western blot. Nous avons également suivi la distribution du fer dans les tissus grâce à une coloration histochimique du fer, permettant de détecter le fer à l’échelle sub-cellulaire.
Enfin, nous avons également initié une étude de la spéciation du fer (identification des ligands) dans les chloroplastes par spectroscopie d’absorption de rayons X en utilisant les lignes de lumière BM8 et ID21 du synchrotron européen de Grenoble.
Rôle du fer dans le nucléole :
La principale fonction du nucléole est de produire des ARN ribosomiques (ARNr). C’est dans ce contexte que le rôle du fer est étudié.
L’expression des gènes codant pour les ARNr a donc été réalisée, par RT-PCR. Cette expression génique peut être visualisée dans le nucléole car les pools de gènes d’ARNr doivent s’associer physiquement au nucléole pour être exprimés. Ceci a été réalisé par hybridation in situ, dans les différents fonds génétiques cité plus haut.

Fer et chloroplaste :
Grâce à la coloration Perls/DAB, nous avons pu montrer que chez les mutants de nicotianamine synthase de grandes quantités de Fe sont accumulées dans les tissus conducteurs (parenchyme du xylème, phloème), ce qui illustre le rôle de la nicotianamine dans le déchargement en Fe des vaisseaux vers les cellules du mésophylle.
Pour essayer de mieux comprendre, au niveau moléculaire, l’effet de la perte de nicotianamine sur la machinerie du transport d’électrons, nous avons quantifié par western blot différents protéines de la chaîne de transport d’électrons. Le principal effet de la perte de nicotianamine est la réduction de l’accumulation des protéines du complexe du cytochrome b6f, du photosystème I ainsi que la plastocyanine, alors que le PSII n’est pas altéré, indiquant que le défaut d’activité photosynthétique des mutants de nicotianamine synthase se situe après le PSII, sur des protéines qui contiennent soit des atomes de Fe (cytochrome b6f, PSI) soit des atomes de Cu (plastocyanine).
Fer et nucléole :
Nous avons pu démontrer que dans des mutants nas, la composition du pool de gènes d’ARNr exprimés était différente que dans les plantes sauvages ou dans les autres plantes mutantes analysées. Plus précisément nous avons observé l’activation des gènes d’ADNr normalement réprimés tandis qu’autres normalement exprimés, sont réprimés. Des analyses plus poussées par Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) ont permis d’observer que la répartition subcellulaire des gènes d’ARNr était en effet perturbée dans ces mutants nas.

Nous avons initié l’étude de la spéciation du fer dans les 2 compartiments ciblés, le chloroplaste et le noyau/nucléole. Les résultats des deux premières sessions au synchrotron de Grenoble ont permis de montrer la faisabilité mais également les limites de ces approches, notamment en ce qui concerne l’adéquation des échantillons avec les limites de détection des lignes utilisées. Les premiers jeux de données obtenues sont en cours d’analyses, en fonction des résultats de nouvelles expériences et approches seront alors envisagées.
Afin de déterminer si la structure du nucléole est affectée lorsque le pool de fer nucléolaire est absent, nous avons créé des lignées nas124 exprimant un marqueur fluorescent du Composé Fibrillaire Dense (DFC), qui sépare les centres fibrillaires (FC) du composé granulaire (GC). Cette approche, non encore publiées, permet de visualiser la structure du nucléole par microscopie confocale, chose qui n’était jusqu’à présent possible que par microscopie électronique.
Nous générons actuellement des lignées transgéniques où seront exprimés dans les plantes sauvages et dans le triple mutant nas124, une protéine chimérique composé de la FERRITINE 1, de la protéine nucléolaire FIBRILLARINE 2 et du marqueur fluorescent YFP (FER1 :FIB2 :YFP). La FERRITINE est une protéine absente du noyau capable de stocker le Fer et de le rendre inutilisable. La FIBRILLARINE est une protéine purement nucléolaire et sa fusion avec la FERRITINE devrait permettre de localiser cette protéine chimérique dans le nucléole. Grâce à la protéine fluorescente YFP, la localisation nucléolaire de cette protéine chimérique pourra être validée par visualisation au microscope confocal. Cette approche devrait nous permettre de « neutraliser » via l’action de la FERRITINE le Fer du nucléole dans les plantes sauvage et ainsi de voir si l’expression et l’organisation des gènes d’ARNr sont affectées dans ces conditions.

Les résultats présentés au-dessus ont été présentés au 17th Symposium on Iron Nutrition and Interactions in Plants (ISINIP), Gatersleben, 6-10 juillet 2014 à travers 2 communications orales par Stéphane Mari (speaker invité) et Lili Wei (post doc du partenaire 1).
Les difficultés (techniques et scientifiques) du projet ont entraîné un certain retard dans la publication des résultats. Plusieurs articles impliquant tous les partenaires sont en préparation (voir section D). Un article portant directement sur le projet a déjà été publié par le partenaire 2 (Montacié et al., 2017).

Le fer (Fe) est un microélément essentiel pour tous les organismes vivants. Chez les plantes, le fer est requis comme co-facteur pour de nombreuses voies de biosynthèse et pour les chaînes de transfert d’électrons de la photosynthèse et de la respiration. La plupart de ces réactions ont lieu dans des compartiments subcellulaires (chloroplaste, mitochondrie…) où le fer doit être correctement distribué. Par ailleurs, le fer en excès peut entraîner la production de radicaux libres fortement toxiques, ce qui contraint les cellules à maintenir une stricte homéostasie pour s’adapter à des conditions fluctuantes. Les facteurs contrôlant la distribution intracellulaire du fer sont toutefois méconnus, alors qu’au niveau de la plante entière les mécanismes d’acquisition du fer sont maintenant très bien caractérisés. Le projet SUBCELIF découle d’un précédent projet ANR (DISTRIMET, 2007-2010). Parmi les faits marquants de ce projet, le partenaire 1 avait mis en évidence la présence du premier transporteur de complexes fer-nicotinamine sur l’enveloppe du chloroplaste (AtYSL6) et isolé un double mutant ysl4ysl6 chez Arabidopsis thaliana affecté dans l’accumulation de Fe chloroplastique, entraînant une forte sensibilité à l’excès de fer. Le partenaire 1 avait également développé une coloration histochimique permettant de détecter le fer à l’échelle subcellulaire, ce qui a conduit à la découverte d’un nouveau site d’accumulation de Fe dans le nucléole.
L’objectif du projet est d’étudier, chez Arabidopsis thaliana, les mécanismes d’allocation du fer dans les organites, d’identifier les ligands impliqués dans la compléxation du fer au sein de ces compartiments et de caractériser le rôle, jusque-là inconnu, du fer dans le nucléole. Le projet SUBCELIF, focalisé sur deux compartiments subcellulaires, répondra à deux questions : quel est le rôle des transporteurs YSL et de la nicotianamine (important ligand métallique) dans l’homéostasie du fer chloroplastique ? Quelle est la fonction du pool de fer nucléolaire ? Le projet réunira 4 partenaires ayant des domaines de compétence complémentaires : physiologie moléculaire et génétique de l’homéostasie du fer (P1, Montpellier), biologie moléculaire et biochimie du fonctionnement du nucléole (P2, Perpignan), analyse de la spéciation des métaux (P3, Pau), imagerie élémentaire (P4, Bordeaux). Les partenaires utiliseront des approches complémentaires permettant de répondre aux questions posées, telles que la génétique inverse, le fractionnement subcellulaire et la biochimie pour caractériser l’activité de transport transmembranaire des protéines YSL et le rôle de la nicotianamine dans les plastes (P1) ; des analyses mécanistiques du métabolisme des ARN ribosomiques et de l’activité de la nucléoline (P2) en fonction de contraintes nutritionnelles en fer (combinaison de conditions de cultures et choix de mutants) pour établir un lien fonctionnel entre le fer et l’activité catalytique du nucléole ; l’imagerie élémentaire par histochimie, émission de fluorescence (XRF) ou de rayons X (PIXE) pour localiser les atomes de fer in situ (P1,P3,P4) ; la spectroscopie d’absorption de rayons X (EXAFS et XANES) et le couplage de chromatographies et de spectrométrie de masse pour identifier les formes chimiques du fer présentes dans les plastes et le nucléole (P3).
La faisabilité du projet est basée sur des publications en commun et sur des résultats préliminaires qui valident l’ensemble des approches. Les retombées attendues du projet sont une meilleure compréhension de l’homéostasie du fer dans le chloroplaste et l’identification d’un nouveau rôle du fer dans un site commun à tous les eukaryotes, le nucléole.