Dynamique de la Chromatine au Cours de la Reproduction chez les Plantes – SEXYCHROM

La reproduction sexuée chez les plantes à fleurs consiste en une succession de transitions développementales: la spécification des cellules germinales à partir de cellules somatiques, la spécification des gamètes mâles et femelles, et la formation du zygote après fusion des gamètes. Le développement des cellules germinales et l’acquisition de la totipotence zygotique s’accompagnent d’une reprogrammation massive de l’épigénome. Des données récentes montrent chez les cellules germinales végétales une architecture chromatinienne spécifique, caractérisée par des patrons atypiques de méthylation des cytosines de l’ADN, de composition en isoformes d’histones H3, et de modifications des histones. La dynamique, la reprogrammation, et la signification biologique de ces états chromatiniens reproducteurs restent à définir. L’objectif de ce projet est donc de déterminer la dynamique de la chromatine au cours de la reproduction chez Arabidopsis thaliana, en détaillant trois modifications épigénétiques: la méthylation de l’ADN, le renouvellement des histones H3, et les modifications covalentes des queues d'histones H3. En s’appuyant sur ces nouvelles données, le rôle des mécanismes contrôlant la mise en place, le maintien et la reprogrammation de cette information épigénétique, et leur fonction biologique pourront être étudiés.
Etudier le remodelage des cellules germinales reste un défi; les évènements correspondant concernent un nombre restreint de cellules et ont lieu dans des laps de temps très courts. Pour ce faire, nous avons développé des lignées exprimant des rapporteurs fluorescents appelés DYNAMET. Ces lignées permettent de suivre en temps réel la méthylation de l’ADN, en contexte CG comme non-CG, dans des cellules vivantes, reproductrices comme somatiques. En combinant notre système DYNAMET avec un jeu de rapporteurs fluorescents couvrant l’ensemble des histones H3 chez Arabidopsis, la dynamique de la méthylation de l’ADN et du renouvellement des histones H3 sera définie au cours la reproduction avec une très bonne résolution spatiale et temporelle. L’étude sera complétée par des analyses de modifications post-traductionnelles des histones H3 par immunocytochimie. L’intégration de ces données fournira une séquence temporelle inédite des états chromatiniens caractérisant les étapes clés de la reproduction sexuée, et la première description des évènements conduisant à la reprogrammation de l’épigénome au cours de la reproduction.
Pour définir les mécanismes contrôlant la mise en place, le maintien et la reprogrammation de ces états chromatiniens, des cribles génétiques seront réalisés à partir de lignées DYNAMET et d’histones H3 étiquetées. A terme, de nouvelles classes de mutants affectant les patrons de méthylation de l’ADN et perturbant le renouvellement des histones H3 au cours de la reproduction seront identifiées. Elles serviront d’outils de base pour aborder la fonction des états chromatiniens dans les lignées germinales. En parallèle nous analyserons la fonction dans ces mêmes cellules de marques d’histones H3 liées à la méthylation de lysines spécifiques (K4, K36), en s’appuyant sur l’étude fonctionnelle des méthyltransférases correspondantes, que nous avons récemment identifiées. Le rôle de ces marques épigénétiques au cours de la reproduction reste encore compris mais les données génétiques indiquent leur participation dans la sporogenèse et la gamétogenèse. Nous aborderont par ailleurs le rôle du renouvellement des histones H3 au cours de la reproduction par l’étude fonctionnelle d’homologues de chaperones d’histones H3 de la famille des UBINUCLEINES, dont des mutants ‘perte de fonction’ présentent des phénotypes reproducteurs forts. Finalement, en combinant marqueurs dynamiques et lignées mutantes, nous étudierons également l’interdépendance fonctionnelle entre les différents niveaux de régulation épigénétiques.