Mécanotransduction par les cavéoles: Rôle dans la signalisation intracellulaire et l'homéostasie cellulaire du cholestérol – MECHANOCAV

Nous utilisons l’expertise de notre collègue physicien pour mettre au point de nouveaux dispositifs micromécaniques permettant d’une part de reproduire des stress mécaniques plus proches de l’environnement physiologique ou physiopathologique des cellules et d’autre part de pouvoir observer en même temps la dynamique des cavéoles sur cellule vivante isolée grâce à des techniques de microscopie sophistiquées à haute résolution. Notre collègue a ainsi mis au point un nouveau dispositif d’étirement uniaxial, miniaturisé et plus simple d’utilisation et qui permet de reproduire les contraintes mécaniques subies par des cellules musculaires. En parallèle, il a validé la conception d’un dispositif microfluidique de cisaillement hydrodynamique qui permet de comparer dans la même zone d’observation des cellules soumises à des cisaillements différents selon une gamme de cisaillements physiologiques comme ceux exercés sur les cellules endothéliales des vaisseaux. Grâce à ces systèmes uniques, nous pourrons observer la dynamique des cavéoles à la surface des cellules et comprendre leur rôle dans la signalisation et le métabolisme du cholestérol. Les voies de signalisation seront identifiées grâce à une technique de criblage à haut débit qui permet de détecter des variations d’activation de protéines impliquées dans l’activation des cellules. Le métabolisme du cholestérol sera analysé grâce aux techniques présentes dans le service de biochimie cardio-vasculaire de l’hôpital européen Georges Pompidou.

Grâce aux dispositifs sophistiqués développés par notre collègue physicien, nous avons pu étudier le devenir des constituants des cavéoles sous les différents types de stress c’est-à-dire choc hypo-osmotique et étirement uniaxial à des temps courts et des temps longs. Nous avons pu visualiser le devenir des constituants des cavéoles dans la cellule en utilisant des techniques de microscopie sur cellule unique telles que le microscope confocal à disque rotatif et la microscopie à ondes évanescentes. Nous avons alors mis en évidence le rôle capital d’une enzyme présente dans les cavéoles dans la réponse mécanique des cellules et dans la stabilité du réservoir de cavéoles à la membrane plasmique. Le rôle de cette enzyme sur la régulation de la tension de la membrane de la cellule a été étudié grâce à la technique d’étirement de nanotubes en collaboration avec les physiciens de l’Institut Curie. Ces résultats ont amené notre équipe à mettre au point de nouvelles lignées cellulaires « genome edited » qui expriment l’enzyme à un taux normal. Par ailleurs, nous avons commencé l’exploration de la réponse cavéolaire dans la signalisation intracellulaire. L’ensemble de ces expériences est répété et comparé sous différents types de stress mécanique.
Les biochimistes de l’hôpital ont aussi étudié le rôle de la réponse cavéolaire dans la régulation du métabolisme du cholestérol (CT). Ils ont analysé la régulation des gènes, dits stérols-dépendants, suite à un excès ou un manque de CT dans les cellules endothéliales humaines. Par souci de relevance physiologique, l’équipe a adapté ces expériences pour observer l’effet des forces de cisaillement (shear stress) qui correspond au flux du sang dans les artères.

Les résultats obtenus lors de ce programme de recherche doivent permettre de comprendre une fonction nouvelle des cavéoles, des structures présentes dans de nombreuses cellules de l’organisme et qui sont impliquées dans plusieurs pathologies sans connaître les mécanismes précis. Ce programme de recherche aura un impact économique et sociétal potentiellement important. Le rôle des forces mécaniques dans la régulation du métabolisme du cholestérol dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins est certainement relié à l’athérosclérose, un problème de santé publique majeur dans les sociétés occidentales. De même, de plus en plus d’études relient la progression des tumeurs cancéreuses aux forces mécaniques. Enfin les myopathies sont reliées à des réponses mécaniques anormales des cellules musculaires.

Nous avons publié avec deux partenaires du programme un article scientifique dans un journal américain spécialisé de très bon niveau (Traffic) sur nos résultats qui mettent en évidence une nouvelle régulation du trafic intracellulaire du cholestérol. Nous comptons breveter les nouveaux dispositifs micromécaniques qui auront été élaborés au cours de ce programme car ils seront utiles à nos collègues intéressés par des études similaires. Les résultats préliminaires obtenus dans ce programme ont déjà été présentés dans le cadre de conférences et congrès scientifiques prestigieux internationaux ce qui témoigne de l’importance et de l’intérêt de nos recherches.

Les cellules perçoivent leur microenvironnement par des signaux solubles, récepteurs, mais aussi par des paramètres mécaniques, tels que la rigidité de la matrice extracellulaire, l’adhésion confinée et la pression de cisaillement du sang dans les cellules endothéliales. Les cellules traduisent ces signaux par mécanotransduction en signaux biochimiques qui contrôlent de multiples aspects cellulaires comme la prolifération, la croissance et la différenciation. Les machineries clefs et les acteurs de la mécanosensation et les voies de signalisation associées sont très peu connues. Il a été suggéré que les cellules puissent s’accommoder d’étirements mécaniques modérés grâce à un réservoir de membrane qui tamponne les variations de tension membranaire. Récemment, en associant de manière unique Physique et Biologie Cellulaire, nous avons établi que les cavéoles, ces invaginations particulières de la membrane plasmique, jouent un tel rôle. Nous avons démontré que les cavéoles agissent comme mécanosenseurs et répondent immédiatement à un stress mécanique en s’aplanissant dans la membrane plasmique (Sinha et al., Cell 2011). Ceci entraine le désassemblage de la structure cavéolaire, ce qui procure un excès de membrane stockée dans l’invagination cavéolaire, maintenant ainsi l’homéostasie de la tension membranaire durant le stress mécanique. Le désassemblage des cavéoles conduit également au relargage de caveoline et de son partenaire, Cavin-1, à partir de la structure cavéolaire.
Nous proposons que le cycle mécano-dépendant de désassemblage/réassemblage des cavéoles et ses conséquences moléculaires, est un événement clef, qui aura un impact majeur sur la signalisation et le métabolisme cellulaires. Pour élucider les mécanismes moléculaires qui contrôlent ce nouvel aspect de la fonction des cavéoles, nous proposons un projet transdisciplinaire qui repose sur trois avancées conceptuelles et techniques majeures présentes dans nos laboratoires : 1) la démonstration récente que les cavéoles sont des mécanosenseurs qui adaptent la cellule aux contraintes mécaniques 2) le développement par les physiciens d’essais mécano-optiques sophistiqués pour mesurer les propriétés mécaniques de la cellule et appliquer des forces mécaniques variées 3) des résultats préliminaires montrant que l’aplanissement des cavéoles contrôle sélectivement la voie de signalisation JAK/STAT.
Nous analyserons :

1) l’impact de nouveaux types de stress mécaniques sur la réponse mécanique de la cellule par les cavéoles (Equipe 1 ; : Pierre Nassoy, Membrane Physics Dept, UMR 168 CNRS/Curie)

2) le rôle de l’aplanissement des cavéoles dans le trafic de la cavéoline et la signalisation cellulaire avec un focus sur la voie JAK/STAT (Equipe 2: Christophe Lamaze, Cell Biology Dept, UMR 144 CNRS/Curie)

3) les liens réciproques susceptibles d’exister entre homéostasie du cholestérol et fonction cavéolaire (Equipe 3: Cardiovascular Biochemistry Unit, Pr JL Paul and coll. HEGP Hospital / School of Pharmacy, Paris 11 University)

En résumé, la ligne de base de notre projet consiste à utiliser l’état de l’art de la biophysique et de la biologie cellulaire présentes à l’Institut Curie pour étudier les conséquences moléculaires de l’aplanissement des cavéoles dans la signalisation et l’homéostasie du cholestérol dans les cellules endothéliales.

Ce projet associe des biologistes cellulaires, des physiciens et des biochimistes cliniciens pour étudier ces questions inexplorées tout en contrôlant les paramètres qui conditionnent la dynamique et la mécanique membranaire. Cette collaboration interdisciplinaire devrait permettre d’obtenir des informations nouvelles et importantes sur la réponse cellulaire aux stress mécaniques et le rôle de la mécanique membranaire, qui émergent comme des facteurs clefs dans plusieurs pathologies comme le cancer, l’athérosclérose et les dystrophies musculaires, mais qui restent très peu explorées au niveau moléculaire.