Contrôle Post-transcriptionnel de l'Expression des Auto-antigènes induite par Aire dans le Thymus – CADET

La tolérance immunologique joue un rôle clé dans le maintien de l’intégrité des organismes en luttant contre l’invasion de micro-organismes d’une part et en respectant les constituants du soi d’autre part. La dérégulation de ce mécanisme peut entraîner la survenue de maladies autoimmunes qui touchent entre 5 à 10% de la population mondiale. Il a été montré que le produit du gène Aire (Autoimmune regulator) joue un rôle majeur dans la tolérance immunologique. En effet, Aire active la synthèse et la présentation par les cellules épithéliales médullaires du thymus (MECs) d’un vaste répertoire d’auto-antigènes (un "miroir du soi"), conduisant à la délétion clonale des thymocytes les reconnaissant (thymocytes autoréactifs) et prévenant ainsi les manifestations autoimmunes. Des avancées importantes ont récemment été réalisées dans la compréhension du mode d’action de Aire en montrant que ce dernier cible des gènes silencieux en se fixant à l’hétérochromatine, recrute la machinerie transcriptionnelle et active l’élongation de la transcription. En plus d’activer l’élongation transcriptionnelle, des résultats préliminaires indiquent que Aire active aussi l’expression de transcrits avec des extrémités 3’UTR courtes dans les MECs matures et que ces cellules présentent une accumulation de miRNAs.
Le but de mon projet est de montrer que Aire est impliqué dans le contrôle post-transcriptionnel de l’expression génétique dans le thymus conduisant à des niveaux plus élevés d’auto-antigènes, ainsi que d'identifier les molécules clées impliquées dans ce mécanisme. Je propose comme premier objectif, de montrer une augmentation générale des miRNAs dans les MECs matures en quantifiant l’expression d’un panel complet de miRNAs. Comme les miRNAs se fixent aux extrémités 3’UTR, et comme la taille de ces dernières est sujette à une régulation dynamique, nous examinerons leurs variations de taille dans les MECs matures en analysant des puces d’expression Affymetrix au niveau de chaque sonde individuelle (objectif 2). Nous testerons le raccourcissement des extrémités 3’UTR par Aire dans les MECs matures sauvages et Aire-déficientes par séquençage à très haut débit des ARNm (objectif 3). Nous effectuerons ensuite des tests avec gènes rapporteurs dans une lignée MEC afin d’évaluer l’augmentation des niveaux protéiques des isoformes ayant des extrémités 3’UTR courtes comparé à celles avec des extrémités 3’UTR longues. Nous mesurerons aussi l’impact des miRNAs sur la répression post-transcriptionnelle, en mutant les sites complémentaires des miRNAs sur les rapporteurs ayant de longues extrémités 3’UTR. Nous identifierons (objectif 4) les facteurs impliqués dans le raccourcissement Aire-spécifique des 3’UTRs. Pour cela, nous mettrons au point un modèle in-vitro basé sur la transfection transitoire d’une lignée MEC avec un vecteur d’expression Aire et d’une construction gène rapporteur luciférase contenant une extrémité 3’UTR dont le transcrit associé subit un raccourcissement Aire-spécifique. Par la suite, de nombreux facteurs se fixant à l’ARN et potentiellement impliqués dans le mode d’action de Aire seront criblés en infectant le modèle mis en place avec des lentivirus contenant des shRNAs. Afin de valider l’effet in-vivo des protéines se fixant à l’ARN et identifiées par le criblage in-vitro (les meilleurs candidats), nous génèrerons des souris Knock-Down par une approche lentigenics dite "à grande vitesse" qui consiste en l’infection d'oocytes de souris par des lentivirus concentrés contenant des shRNAs(objectif 5). Les résultats attendus devraient révéler un nouveau mécanisme important de contrôle de l’expression des auto-antigènes dans le thymus et permettre d’identifier de nouvelles cibles pour le traitement des maladies autoimmunes.