Réseaux inducteurs de la crete neurale: approches intégrées in vivo et en cellules souches – CRESTNET

Nous combinons des approches de puces ADN, de séquençage nouvelle génération et d'hybridation in situ, pour établir la signature moléculaire des progéniteurs de la crete neurale. Nous abordons de plus les cibles de pax3 dans ce processus, sur puces, ADN, et par validation in vivo. De plus, nous mettons en oeuvre des stratégies de culture in vitro de cellules souches humaines et des manipulation d'embryons de xénope in vivo, pour élucider les mécanismes de l'induction de la crete neurale.

Nous avons, au cours de ces 6 premiers mois:
- défini une première signature de la crete neurale, utilisant des puces ADN,
- commencé à explorer le réseau des cibles de pax3
- déterminé que pax3 associé à zic1 est la combinaison la plus efficace pour induire la crete neurale ,
- déterminé les potentialités des cellules de xénope induites à exprimer pax3 et son partenaire zic1

Nos objectifs suivants sont
- de produire une signature de la crete neurale plus complète en utilisant le NGS
- de fournir le réseau des cibles de pax3, directes et indirectes
- de définir des protocoles de reprogrammation en crete neurale efficaces in vitro à partir de cellules souches humaines.

en cours

La découverte récente de la reprogrammation de cellules adultes en cellules souches pluripotentes (iPS), semblables aux cellules souches embryonnaires, a ouvert le défi de savoir rediriger ces cellules vers des destins cellulaires précis puis de contrôler leur différenciation. Des études in vitro montrent que les iPS répondent aux signaux agissant dans l’embryon. Ce domaine nouveau reste néanmoins largement à explorer, notamment pour des lignages complexes.

Nos recherches se focalisent sur les étapes les plus précoces du programme de développement de la crête neurale (CN), une population multipotente et migratoire, spécifique des embryons de vertébrés. La CN émerge du tube neural dorsal par une transition épithélium-mésenchyme et forme, entre autres, le système nerveux périphérique, les cellules pigmentées, et le squelette craniofacial. Les mécanismes moléculaires et cellulaires de la migration et de la différenciation de la CN sont étudiés depuis de longues années et relativement bien compris. En revanche, c’est seulement au cours des dernières années que les mécanismes d’induction de la CN au cours de la gastrulation et au tout début de la neurulation ont été abordés. Notre équipe a largement participé à cet aspect et produit de nombreuses données expérimentales, qui ont démontré le rôle essentiel du facteur de transcription Pax3 dans l’initiation du programme donnant la CN in vivo. Nous avons donc activement contribué à la construction du premier réseau génique putatif régissant l’émergence de la CN.

Un défi majeur de ce domaine de recherche est de transformer ce premier réseau, basé sur des relations épistatiques, en un réseau de régulations directes. Nous avons développé outils et approches complémentaires pour rechercher les cibles et les régulateurs de pax3, durant l’initiation de la CN, en combinant des approches génomiques et leur validation in vivo. Notre premier objectif comprend ainsi des analyses du transcriptome (puces ADN et séquençage nouvelle génération RNAseq) et de l’hybridation in situ, pour réaliser le profil moléculaire des progéniteurs de la CN. Il comprend également la recherche à l’échelle du transcriptome des cibles directes potentielles de pax3, ainsi que l’analyse des régions régulatrices du gène pax3 pour identifier des régulateurs directs. Nous construirons ainsi un nouveau réseau de régulations géniques directes, centré sur pax3, et porterons une attention particulière aux gènes intervenant dans la multipotence des cellules et dans la transition épithélium-mésenchyme.

Notre deuxième défi est d’appliquer le savoir accumulé dans les organismes-modèles à la biologie des cellules souches humaines. Nous avons développé des stratégies utilisant des cellules souches d’amphibien et des cellules iPS humaines, pour analyser l’induction du lignage de la CN puis la différenciation de ces cellules, dans des conditions totalement définies in vitro, en comparant à l’induction de cellules souches neurales. Notre hypothèse est que les inducteurs embryonnaires de CN, Wnt et Pax3, pourraient diriger les cellules souches vers une destinée CN. Nous rechercherons des conditions expérimentales permettant d’obtenir des cellules de CN multipotentes, capables de se différencier en plusieurs types de dérivés, dans des conditions controlées.

Les quatre équipes du consortium CrestNet ont des expertises complémentaires, en biologie de la CN et des cellules souches, en génomique et en bioinformatique. Nous avons déjà produit de nombreuses données préliminaires pour les deux objectifs de ce projet, en développant des recherches communes. Nous pourrons donc efficacement coopérer pour fournir, d’une part, le réseau de régulations en amont du programme de développement de la CN, liant ainsi la polarisation médio-latérale de la plaque neurale à l’induction de la CN, et, d’autre part, utiliser ce savoir pour contrôler expérimentalement la formation de CN multipotente et fonctionnelle à partir de cellules souches reprogrammées.