Biodégradabilité des composés oxygénés des essences (ETBE et MTBE): Micro-organismes - Mono-oxygénases - Fonctionnalité – MiOxyFun

Les éthers, méthyl tert butyl ether (MTBE) et éthyl tert butyl ether (ETBE), sont ajoutés aux essences pour maintenir leur indice d'octane. Ils sont très solubles dans l'eau (40 et 10 g.L-1, respectivement). Leur utilisation massive impose d'évaluer leur devenir dans l'environnement et dans les aquifères. Le MTBE a été détecté dans des aquifères après des pollutions par des essences additivées du fait de sa faible biodégradabilité. Á notre connaissance, la contamination par l'ETBE n'a pas été étudiée dans les pays qui l'utilisent, dont la France et la Hongrie. Il est donc nécessaire d'étudier l'impact environnemental du MTBE et de l'ETBE et de caractériser les microorganismes, les enzymes et les gènes impliqués dans leur dégradation.

Le projet est basé sur une collection de microcosmes dégradant le MTBE ou l'ETBE issus de divers lieux géographiques obtenue en Hongrie et en France. Elle permettra d'étudier:

- Les oxygénases, responsables de l'oxxxydation du MTBE et de l'ETBE. Nous caractériserons leurs capacités de biodégradation du MTBE et de l'ETBE en déterminant (i) leurs cinétiques de biodégradation, (ii) la production de tert-butyl alcool (TBA), intermédiaire de biodégradation du MTBE et de l'ETBE, (iii) les interactions négatives ou positives avec d'autres composés des l'essences (hydrocarbures mono-aromatiques ou BTEXs et n-alcanes).
Nous caractériserons leurs capacités de biodégradation vis-à-vis d'autres composés ayant différentes structures chimiques afin de comprendre leur spécificité et leur capacité à dégrader des molécules présentant un fort encombrement stérique (fonction tertio-butyl).
L'activité de ces oxygénases sera aussi étudiée par expression hétérologue des gènes dans des systèmes bactériens adaptés ce qui est essentiel pour prouver le rôle et la fonction des enzymes.

- La composition phylogénétique des microcosmes: (i) par électrophorèse en gradient de gel dénaturant (DGGE) puis (ii) en isolant les microorganismes et en évaluant leurs capacités de dégradation du MTBE et de l'ETBE. Enfin, (iii) en couplant la méthodologie SIP (Stable Isotope Probing) et l'observation à l'aide d'un NanoSIMS, démarche s'appuyant sur le marquage des microorganismes par du 13C-ETBE ou du 13C-MTBE dont l'objectif est d'identifier les microorganismes impliquées dans la biodégradation et de déterminer si des microorganismes non cultivables peuvent dégrader le MTBE ou l'ETBE.
Deux souches dégradant le MTBE et l'ETBE seront choisies et leur ADN génomique séquencé et annoté.

- Les gènes induits en présence d'ETBE ou de MTBE:
*En recherchant plusieurs gènes déjà identifiés dans les voies de biodégradation du MTBE et de l'ETBE: (i) ethB codant pour un cytochrome P450 oxydant l'ETBE, (ii) mdpA, codant pour une enzyme proche des alcanes hydroxylases, (iii) mpdB et mpdC codant pour des déshydrogénases responsables de la production de l'acide 2-hydroxyisoburique (HIBA) au cours de la dégradation du TBA et (iv) icmA codant pour une mutase impliquée dans l'assimilation du HIBA. Nous rechercherons ces gènes dans les microcosmes et les souches isolées. Puis nous étudierons leur expression (RTqPCR) sur ETBE ou MTBE par comparaison avec un substrat non inducteur.
*Par une étude transcriptomique par RTqPCR haut débit (OpenArrayTM RTqPCR nanocapillaire) qui sera réalisée sur les 2 souches séquencées afin de déterminer le pool de gènes surexprimés en présence de MTBE ou d'ETBE.

Á notre connaissance, aucune étude intégrée à différents niveaux (microorganismes, oxygénases et gènes ) ayant pour base un nombre significatif de microcosmes d'origines géographiques diverses dégradant le MTBE et l'ETBE n'a été réalisée. Cette étude apportera des données précieuses sur la diversité des microorganismes dégradant le MTBE et l'ETBE, sur la spécificité et le mode d'action des oxygénases et sur les gènes impliqués dans les voies de biodégradation. Elle apportera des perspectives nouvelles sur l'impact environnemental de ces éthers.