LES RONGEURS DIURNES TRANSGENIQUES ET LA MALADIE DE STARGARDT: MODELES ANIMAUX PERTINENTS DE LA DEGENERESCENCE MACULAIRE HEREDITAIRE – TRANS-STAR-CONE

La maladie de Stargardt (STGD) représente la forme la plus fréquente de dégénérescence maculaire héréditaire, une cause majeure de la cécité humaine. Cette maladie est due à des mutations dans l'ABCA4, enzyme « flippase » spécifique de la rétine qui joue un rôle crucial dans le cycle visuel. STGD affecte exclusivement les cônes, ce qui amoindri l'utilisation de souris transgéniques comme modèle, la rétine murine contenant que très peu de ce type cellulaire (<3%). Nous avons montré que la rétine du rongeur diurne Arvicanthis ansorgei est très riche en cônes (>10 fois plus que la souris), et possède des propriétés morphologiques et physiologiques qui en font un modèle très avantageux pour étudier la pathophysiologie des cônes et la vision humaine. Le but de ce projet innovant est de créer des lignées transgéniques d'A. ansorgei dans lesquelles l'ABCA4 est inhibé par l'ARN interférence, et d'analyser les modifications structurales et fonctionnelles des cônes et de la rétine. Le gène ABCA4 d'Arvicanthis a été cloné par homologie, et transfecté de manière stable dans les fibroblastes HepG2. Des siRNA dirigés contre la séquence d'ABCA4 sont actuellement testés pour inhiber son expression. Après optimisation, les siRNA seront incorporés dans des vecteurs viraux et injectés dans des oocytes de femelles super-ovulantes. Les oeufs viables injectés seront implantés dans des femelles pseudo gestantes et les petits criblés pour l'expression du transgène. Le niveau d'expression d'ABCA4 sera étudié par qPCR et western blot, et les animaux sauvages et homozygotes seront testés durant la différenciation et la maturation (2 x 3 points). Un groupe sera élevé dans des conditions de faible éclairage. Les cônes seront examinés par différents tests structuraux (histologie pour étudier l'intégrité des segments externes et le nombre des cellules ; immunohistochimie des protéines spécifiques des cônes et des bâtonnets pour analyser l'organisation sub-cellulaire ; indicateurs de l'apoptose, bioessais pour suivre la phagocytose des photorécepteurs) et fonctionnels (réponse visuelle scotopique et photopique enregistrée par électrorétinographie). Un mécanisme pathologique majeur dans STGD concerne l'accumulation de lipides toxiques dans l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), et nous suivrons in vivo la distribution des dépôts de lipide dans la rétine par l'examen du fond d'oeil et angiographie fluorescente, et analyserons la composition biochimique des accumulations de lipides dans la rétine et l'EPR par HPLC et spéctrométrie de masse. Les équipes impliquées dans ce projet possèdent toutes une forte expérience dans leurs champs de compétence (Equipe1 : structure rétinienne, biologie cellulaire et développement ; Equipe 2 : génétique rétinienne humaine et neurodégénérescence ; Equipe 3 : production d'animaux transgéniques par vectorisation virale ; Equipe 4 : analyse de la fonction visuelle et biochimie des lipides). Comme la STGD commence dès l'enfance chez l'Humain, nous pensons que la dégénérescence rétinienne (surtout des cônes) apparaitra relativement tôt, d'où la programmation d'une étude postnatale (7, 15 et 30 jours) et chez l'adulte (2, 3 et 6 mois). Comparés à des animaux sauvages du même âge, nous attendons des altérations de la fonction des cônes (qui seront détectées par ERG - flash unique et flickers) ainsi que la mort cellulaire accrue et une désorganisation des segments externes chez les animaux transgéniques homozygotes. Si le modèle est fidèle à STGD, la structure et la fonction des bâtonnets devraient être moins touchées que celles des cônes. Les niveaux résiduels de ABCA4 seront analysés par qPCR et western blot. Il est admis que le mécanisme pathologique majeur de la STGD est l'accumulation de lipides toxiques dans l'EPR ; nous étudierons donc l'apparition et la composition biochimique des dépôts lipidiques.