Exploration des modes de recrutement de l'EJC et son role dans la régulation de l'expression des gènes – ExploreEJC

Chez les eucaryotes, les ARN messagers (ARNm) sont couverts d'un grand nombre de protéines qui ont un impacte majeur sur la localisation sub-cellulaire, l'efficacité de traduction et la demi-vie des ARNm. Un défi important est de disséquer les mécanismes moléculaires par lesquels ce manteau protéique variable régule la destinée des ARNm. Dans ce contexte, le complexe multiprotéique EJC (Exon Junction Complex) déposé sur les ARNm nucléaires par la machinerie d'épissage est un effecteur central de la fonction des ARNm. Chez les mammifères, l'EJC active la traduction des ARNm, participe à leur transport dans la cellule et sert au contrôle de leur intégrité. Des progrès importants ont été fait pour décrire la structure et les diverses fonctions de l'EJC. Cependant, le mécanisme exact de recrutement de l'EJC par le spliceosome ainsi que son assemblage in vivo restent inconnus. Contrairement à la vision générale actuelle, plusieurs études fonctionnelles suggèrent fortement que l'EJC pourrait ne pas être déposé par chaque événement d'épissage. Les objectifs de notre projet sont : (i) de disséquer les mécanismes de recrutement de l'EJC par le spliceosome et (ii) d'identifier les jonctions exoniques associées à un EJC. Notre but ultime est de déterminer en quelle mesure la modulation du dépôt de l'EJC pourrait constituer un nouveau moyen de réguler l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel chez les métazoaires. Dans ce but, nous envisageons les trois taches suivantes : Tache 1 : Des approches in vitro et biochimiques seront employées pour identifier les facteurs qui recrutent les protéines de l'EJC dans le spliceosome (partenaire 1). En parallèle, l'assemblage de l'EJC sera directement analysé in vivo dans des cellules vivantes par diverses techniques comme le FRET (partenaire 3) et les structures nucléaires où l'assemblage de l'EJC a lieu (perispeckles) seront étudiées par microscopie électronique. Tache 2 : Des résultats préliminaires de l'équipe du partenaire 1 révèlent que chez la drosophile, un EJC instable est assemblé sur des ARNm épissés in vitro. Le partenaire 1 recherchera les facteurs capables de stabiliser l'EJC. Tache 3 : Si le dépôt de l'EJC est régulé, il serait extrêmement informatif de connaître les junctions exoniques auxquelles il est associé. Ces jonctions exoniques seront isolées par immunoprécipitation et identifiées par une méthode de séquençage à haut débit. Cette méthode sera d'abord développée pour analyser des ARNm cellulaires de drosophile dont seule une faible fraction est potentiellement liée à un EJC, avant d'appliquer cette stratégie à l'analyse de transcriptomes humains.