– RNA-mitotar

Les mitochondries sont des organites essentielles aux fonctionnement de cellules eucaryotiques qui contiennent leur propre génome (ADNmt) et participent aux processus aussi divergents que la production de l'ATP ou l'apoptose. L'ADNmt ne contient qu'une information limité, la majorité de macromolécules étant codées dans le noyau et adressées dans l'organite. Contrairement au processus d'import des protéines, étudié en détails, l'adressage des ARN dans les mitochondries l'est beaucoup moins, malgré le fait que cette voie est très largement répandu. L'import d'ARN étant l'unique voie d'adressage d'acides nucléiques dans la mitochondrie in vivo, l'étude de son mécanisme est d'une importance fondamentale. D'autre part, il est à noter que de nombreuses maladies humaines sont associées à des mutations de l'ADNmt et la voie d'import d'ARN offre une possibilité de complémenter ces mutations. Cette possibilité est en cours de exploration dans notre équipe, en collaboration avec les collègues travaillant dans le milieu hospitalier. N'en demeure moins, la compréhension des mécanismes d'import est loin d'être suffisante pour répondre à tous les défis que pose son application biomédicale. Le projet actuel vise combler cette lacune. Comme modèles d'étude, nous proposons d'utiliser la levure, important des ARN de transfert, et des cellules humaines, qui importent l'ARN ribosomique 5S. Ces deux modèles ont déjà été exploité dans notre équipe pour obtenir plusieurs données cruciales concernant l'import d'ARN dans les mitochondries, reportées dans les revues du plus haut niveau (Science, Genes & Dev, Mol Cell, EMBO J, PNAS, etc.). Chez la levure, les facteurs essentiels d'import de l'ARNt, ainsi que les séquences de cet ARN déterminant son adressage mitochondrial ont été identifiés; la fonction de l'ARNt dans l'organite a été également établie. Dans les cellules humaines, la ressemblance de conditions permettant l'import de l'ARNr 5S et celles permettant import d'ARNt chez la levure a été mise en évidence et les séquences de l'ARNr 5S nécessaires à son import ont été identifiées. Le projet actuel vise à étendre ces résultas et effectuer une véritable percée par des nouvelles expériences ceci permettant d'intégrer la voie d'import dans le patchwork complexe du trafic macromoléculaire. Trois objectifs majeurs seront poursuivis: (1) caractériser les facteurs protéiques d'adressage et de translocation d'ARN dans les mitochondries; (2) déterminer le mécanisme moléculaire d'interaction entre ces facteurs et les ARN importés; (3) décrire le binôme structure-fonction pour les modèles exploités. La recherche de facteurs d'adressage va concerner le modèle humain. Nous allons utiliser les approches biochimiques (séparation de macromolécules et tests d'import in vitro) et protéomiques afin d'identifier les candidats, suivis de reconstitution du système à partir de protéines recombinants et de tests de validation par extinction de gènes correspondants par interférence d'ARN. Les récepteurs impliqués dans la translocation d'ARN dans les mitochondries de levure et humaines seront identifiés par masquage de protéines connus de la surface mitochondriale et par pontage ARN-protéine en cours de l'importation. L'interaction entre les facteurs d'import déjà connus ou nouvellement identifiés et les ARN importés sera étudiée par les méthodes d'empreintes, retard sur gel et gels natifs, la première permettant de décrire le mécanisme moléculaire d'interaction, les seconds - de modéliser la dynamique de formation des complexes. La partie fonctionnelle du projet sera axée sur les objectifs différents dépendant du système. Chez la levure, ou la fonction de l'ARNt importé a déjà été déterminée comme adaptation de la traduction aux conditions de stress, la régulation de l'import sera étudiée. Comme nos travaux récents ont démontré, la régulation se passerait par la dégradation de facteurs positifs (d'import) et négatifs (de rétention) par le système UPS (Ubiquitine-Proté