Systematic videomicroscopy examination of cell death modalities: an RNA interference study – CellDeathModes

La mort cellulaire peut se manifester sous différentes formes, en particulier l'apoptose (aussi appelé mort cellulaire programmée, MCP, de type 1), l'autophagie (MCP de type 2), la nécrose (MCP de type 3), la catastrophe mitotique et l'entose (cannibalisme cellulaire). La régulation moléculaire de ces différents types de mort cellulaire et les mécanismes qui « décident » des voies de désintégration sont largement inconnus. Dans ce projet, nous proposons le développement de techniques de vidéo-microscopie à fluorescence pour la détection simultanée de différentes modalités de mort cellulaire, suivie par le criblage de chimiothèques ou de génothèques de siRNAs (y compris des puces spécifiquement développées pour la transfection de siRNAs) afin d'identifier des agents chimiques ou des siRNAs qui affectent les réponses cellulaires aux stimuli létaux aux niveaux quantitatif ou qualitatif. Nous transfecterons des cellules avec des biosenseurs de l'apoptose (pour détecter la perméabilisation de la membrane externe des mitochondries avec un dérivé fluorescent du cytochrome c, l'activation de la caspase-3 avec un substrat fluorogène, la condensation de la chromatine avec une protéine de fusion entre histone H2B et GFP) et l'autophagie (en suivant l'aggrégation de LC3, en utilisant une protéine de fusion entre LC3 et dsRed). Un test robuste, sensible et spécifique sera développé pour la détection simultanée de l'apoptose et de l'autophagie. Ce système sera ensuite utilisé pour cribler des chimiothèques thématiques afin d'identifier de petites molécules qui inhibent ou accroissent l'induction de l'autophagie et/ou de l'apoptose (conjointement ou séparément) ou qui transforment une réponse apoptotique en réponse autophagique (ou vice-versa). De manière analogue, ce système sera utilisé pour cribler des siRNAs qui modifient (inhibent, augmentent ou transforment) la mort cellulaire, ceci en comparant des transfections exécutées sur microplaque ou sur microarray. Nous introduirons dans les cellules des biosenseurs pour la détection de l'apoptose ainsi que des sondes fluorescentes permettant la visualisation de la catastrophe mitotique (en déterminant des aberrations de la distribution chromosomique avec H2B-YFP ou du nombre de centrosomes avec centrine-RFP ce qui permettra la détection des métaphases anormales, des micronoyaux ou des multi-nucléations). Ainsi la vidéo-microscopique permettra de déterminer si la catastrophe mitotique survient avant, après ou simultanément à l'apoptose, en réponse à des stimuli adéquats. Nous utiliserons ce système pour cribler des chimiothéques et des bibliothèques de siRNAs et donc pour identifier des agents chimiques ou des produits géniques qui régulent la manifestation de la catastrophe mitotique ou qui modifient sa relation avec l'apoptose. Nous développerons des tests de vidéo-microscopie pour détecter la nécrose programmée (en suivant la translocation de HMGB1-YFP du noyau au cytosol et celle d'AIF-dsRED de la mitochondrie au noyau, tout en contrôlant l'absence de condensation chromatinienne apoptotique avec histone H2B-GFP) ou l'entose (le cannibalisme cellulaire qui peut être détecté en suivant deux fluorochromes marquant des cellules différentes dans leur intégralité). Des modulateurs (agent chimiques ou siRNAs) de l'apoptose, de l'autophagie ou de la catastrophe mitotique seront aussi évalués pour leur capacité à influencer la nécrose programmée et l'entose. Des analyses épistatiques, par double intervention (par exemple par transfection simultanée avec deux siRNAs ou traitement avec deux agents pharmacologiques) seront utilisées pour identifier les voies principales (les « nœuds » de signalisation) qui régulent les différentes modalités de mort cellulaire et leurs interconnections. Ces agents « sensibilisateurs », « inhibiteurs » ou « transformateurs » (petites molécules ou siRNAs) seront utilisés pour perturber les différentes voies de mort cellulaire et pour explorer les effets combinés. Cette a