– TRANSFOLDPROT

Les membranes de lipides sont des barrières physiques qui délimitent la cellule et isolent les fonctions biologiques dans des compartiments bien définis. De nombreuses protéines doivent les franchir ou s'y insérer pour trouver leur place correcte dans la cellule. Les protéines « transloquées » sont en général dans un état déplié; elles doivent être repliées correctement pour acquérir leurs propriétés fonctionnelles, ou elles restent dépliées pour être dégradées. De nombreuses pathologies sont associées à un mauvais repliement ou à un mauvais transport des protéines, et il est important d'étudier ces deux processus et leur relation. Notre projet consiste à étudier les différents mécanismes physiques et biologiques de la translocation, les interactions entre protéines et le repliement des protéines après leur passage à travers différents pores protéiques. Les expériences seront effectuées en dynamique au niveau d'une molécule unique en utilisant des techniques d'électrophysiologie et de fluorescence à une résolution spatiale et temporelle de l'ordre du nanomètre et de la microseconde. Nous étudierons le transport de protéines à travers des canaux protéiques de toxines bactériennes de géométries différentes, l'alpha-hémolysine et l'aérolysine, insérés dans des bicouches lipidiques, entre deux compartiments isolés où les conditions de dénaturation/ dépliement, ou de renaturation/repliement, seront contrôlées. Nous étudierons ainsi la translocation de protéines dépliées ou partiellement repliées et leur repliement éventuel en sortie de canal. Un champ électrique appliqué entraînera les protéines à travers les pores. Leur translocation sera détectée par des techniques d'électrophysiologie et de fluorescence. Nous utiliserons les pores comme capteurs de conformation et comme outils de mesure des forces engendrées dans les processus de translocation et de repliement, en particulier celles associées aux interactions entre chaperons et protéines transportées. Nos expériences exigent des canaux qui résistent à la dénaturation. C'est le cas des toxines utilisées. Nous avons choisi comme modèle de protéine à transloquer, la MBP (Maltose Binding Protein), une protéine périplasmique d'E. Coli car son activité est détectable à des concentrations ultra-faibles et parce qu'elle possède des mutants de translocation et de repliement. Ces protéines sont complètement dépliées à des concentrations en dénaturant ou des températures peu élevées, tandis que les pores et les protéines chaperons restent fonctionnels. Ce projet est la première étape pour étudier une machinerie de translocation cellulaire.