Origines de réplication et identité cellulaire – ORIC

L'hypothèse sous-jacente à nos travaux ainsi qu'à ce projet est de considérer les origines de réplication comme des éléments de charpente du génome dont la localisation contrôle l'expression des programmes génétiques. A ce titre, un codage différent des chromosomes par les origines contribuerait à l'identité cellulaire au cours du développement et de la différenciation. Notre laboratoire a été probablement le premier à postuler ce concept origines de réplication et identité cellulaire et le premier à démontrer la variation du positionnement des origines de réplication en fonction des programmes de différenciation. Chez les mammifères, environ 50 000 origines sont utilisées à chaque division, mais moins de 0,1% ont été caractérisées. Ces origines démarrent en des endroits précis du génome, mais elles ne présentent aucun consensus de séquence, au contraire de la bactérie ou de la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce paradoxe est une des grandes énigmes de la biologie actuelle chez l'eucaryote multicellulaire où, à la différence du monde bactérien, la croissance cellulaire doit s'accorder à la différenciation. La difficulté à caractériser des origines de réplication pourrait refléter leur plasticité. Nous avons proposé qu'elles ne sont pas fixes sur le génome eucaryote, mais disposées selon le patron d'expression génique de la cellule (Mechali 2001). Au cours de l'évolution, cette transition de la spécificité de séquence vers la spécification épigénétique pourrait avoir été cruciale dans la diversification cellulaire. Elle contribuerait à la plasticité requise par un organisme multicellulaire pour exprimer une multitude de programmes génétiques dans ses différents tissus à partir d'un même texte génétique. La mise en place des origines de réplication, son importance dans le développement et la différenciation, son importance dans la re-programmation de noyaux de cellules différenciées en noyaux totipotents, constituent un premier objectif de ce projet. Nous voulons déterminer le code origine dans des cellules souches embryonnaires pluripotentes ou en voie de différentiation, définir ainsi les origines régulatrices, associées à des programmes de transcription spécifique, valider le concept d'origine lié à l'identité cellulaire. Les modèles murins et humains seront utilisés, et cette approche est une approche originale reconnue de notre laboratoire. La cartographie se fera par purification des brins naissants aux origines, amplification, et analyse sur puces à ADN. Ces méthodes ont été validées au laboratoire, et nous avons, semble-t-il, une certaine avance technologique dans ce domaine. Une analyse par PET-sequencing est également initiée en collaboration. Une attention particulière sera portée à des domaines spécifiques actifs ou éteints dans l'état pluripotent ou l'état différentié, afin de découler des analyses fonctionnelles des origines correspondantes dans le développement et la différenciation. Nous désirons effectuer un KO d'origine spécifique d'un domaine impliqué dans la différentiation et en analyser les conséquences phénotypiques. Un résultat positif serait une première impliquant les origines de réplication comme élément génétique de la différentiation. Nous voulons également analyser comment la déprogrammation des origines influe le retour à un caractère pluripotent de l'identité cellulaire. L'identification des facteurs impliqués dans la reconnaissance des origines et le licensing de réplication, leur fonction dans les phénomènes décrits dans le premier objectif constituent notre deuxième axe de recherche. Aucune spécificité de séquence n'a été détectée pour ces protéines, et aucune des protéines de réplication connues ne permet de comprendre comment les origines de réplication sont sélectionnées. Nous proposons deux nouveaux types de criblage mis au point au laboratoire dans le but d'isoler les facteurs impliqués dans la reconnaissance génétique et épigénétique des origines de réplication. Un criblage de facteur