Analyse structurale et fonctionnelle des systèmes catalysant la conversion des uridines en pseudouridines dans les ARN d'archaea – ARCHPSI

La modification post-transcriptionnelle la plus fréquente des ARN est la conversion des uridines en pseudouridines (Psi). Elle permet de former des liaisons hydrogène supplémentaires en interne ou avec des partenaires et elle augmente la stabilité des appariements de bases. Elle est souvent trouvée dans les régions fonctionnelles des ARN. Chez les Archaea et les eucaryotes, deux systèmes distincts sont utilisés pour catalyser la formation de cette modification, soit des enzymes de nature protéique, les ARN:Psi-synthases, soit des particules ribonucléoprotéiques, snoRNP chez les eucaryotes, sRNP chez les Archaea. Elles contiennent un ARN qui définit la position à modifier par appariement de bases avec le substrat et un groupe de 4 protéines, dont aCBF5, qui présente les caractéristiques des ARN:Psi-synthases. Notre objectif est d'apporter la vision la plus complète possible de l'ensemble des pseudouridylations ayant lieu dans les ARN d'une espèce d'archaea hyperthermophile, T.kodakaraensis, que nous avons choisie parce que des outils génétiques ont été développés au Japon pour cet organisme. Pour identifier les différents types de catalyseurs responsables de la formation des modifications d'ARN identifiés, les deux partenaires du projet développeront pour la première fois en France, un système génétique applicable aux archaea hyperthermophiles. Il nous permettra de réaliser des mutations et délétion de gènes, afin d'identifier leur fonction, en l'occurrence l'identité des substrats des ARN :Psi-synthases étudiées. Les génomes d'archaea contiennent très peu de gènes codant des protéines possédant la signature caractéristique des ARN:Psi-synthases déjà identifiées dans les autres domaines du vivant. La question est donc de savoir, si les archaea contiennent moins d'ARN:Psi-synthases qui ont une plus large spécificité d'action, ou si elles renferment des enzymes ayant des caractéristiques différentes de celles déjà connues. L'avantage de travailler sur les archaea hyperthermophiles est de pouvoir plus facilement cristalliser leurs protéines et déterminer leurs structures 3D par diffraction des RX. Nous avons débuté la caractérisation d'une protéine d'archaea homologue à une enzyme trouvée chez les bactéries et les eucaryotes. Sa spécificité d'action semble être très élargie chez les archaea. Nous avons obtenu des cristaux et sa structure 3D devrait être rapidement résolue. Les autres enzymes qui seront identifiées seront étudiées selon la même démarche, incluant la disruption de leur gène et l'analyse de l'effet produit sur la modification des ARN par l'approche CMCT-RT. En parallèle, nous avons comme objectif d'apporter des informations sur les sRNP H/ACA d'Archaea, ceci pour comprendre comment ces catalyseurs très particuliers, s'assemblent, reconnaissent spécifiquement leur substrat, le modifient et le libèrent après modification. Nous avons joué un rôle pionnier dans le développement d'une approche in vitro permettant d'assembler des sRNP H/ACA actives à partir d'un ARN transcrit in vitro et des protéines recombinantes. Nous exploiterons cette approche pour tester l'importance des diverses interactions mises en évidence entre les composants de ces particules par des analyses structurales, ainsi que de certains acides aminés très conservés d'aCBF5. Nous avons déjà contribué à la connaissance structurale de ce système et nous tenterons d'obtenir des cristaux à partir d'une sRNP H/ACA entière liée à un substrat, ceci en utilisant des mutants de l'enzyme aCBF5 déjà produits qui ralentissent le départ de l'ARN-substrat de site actif. Nous avions montré en même temps que d'autres, que le complexe de protéines des sRNP H/ACA peut agir en position 55 des ARNt sans ARN guide, nous essayerons de cristalliser ce complexe de protéines avec un ARNt pour pouvoir réaliser une étude approfondie de ses relations structure-fonction. Nous avons développé une méthode informatique permettant de rechercher avec une grande efficacité les gènes poten