Dissection moléculaire des fuites rénales de phosphate – MODIRPIT

L'excrétion urinaire de phosphate (Pi) dépend de l'activité de systèmes de cotransport Na-Pi épithéliaux (NPT2a et NPT2c) dont l' expression et l' activité sont contrôlées par des protéines régulatrices intracellulaires (protéines NHERF à domaines PDZ), et des facteurs hormonaux (PTH, vitamine D, FGF23) ou locaux (Klotho). Les anomalies de transport rénal du phosphate (Pi) entrainent une fuite urinaire de Pi, une hypophosphatémie et sont à l'origine de lithiases rénales et de déminéralisation osseuse. Les objectifs du projet sont d'identifier des causes constitutionnelles des fuites de Pi: (a) de rechercher, chez des patients porteurs de ce syndrome, des mutations des transporteurs NPT2a et NPT2c, des protéines régulatrices NHERF1 et NHERF2, de l'hormone FGF23 et de son cofacteur Klotho; (b) de caractériser ces mutations en les exprimant dans des systèmes hétérologues (ovocytes de Xénope, lignées cellulaires); (c) d'élucider le mécanisme de la perte de fonction des protéines mutées.//A partir d'une cohorte déjà constituée de patients atteints de lithiases rénales ou de déminéralisation osseuse et d'hypophosphatémie, les étapes suivantes seront réalisées: (a) séquençage, à la recherche de mutations, de la région codante des cotransporteurs NPT2a et NPT2c, des protéines régulatrices NHERF1 et NHERF2, de FGF23 et de Klotho; (b) expression hétérologue de ces protéines: les transporteurs NPT2a et NPT2c seront exprimés dans des ovocytes de Xénope et dans des lignées cellulaires rénales (HEK293, MDCK, OK), les protéines NHERF et Klotho dans des lignées cellulaires (HEK293, OK) et la production de FGF23 muté recombinant sera effectuée dans un système E. Coli; (c) caractérisation fonctionnelle de ces protéines combinant plusieurs approches expérimentales: pour les transporteurs, étude de l'activité de transport de Pi (NPT2a, NPT2c) et d'enregistrement de courant (NPT2a est électrogénique); pour les protéines NHERF modulation du transport de Pi par des transporteurs endogènes ou transfectés; pour FGF23 et Klotho, modulation de l'activité de transport de Pi et activité glucuronidase pour Klotho; (d) adressage et interactions protéine-protéine: l'adressage membranaire des mutants NPT2a et NPT2c sera étudié grâce à des protéines taguées, leur dimérisation sera étudiée (cross linking); l'interaction entre NPT2a ou le récepteur de la PTH et NHERF sera étudiée par blot overlay et immunoprecipitation; l'interaction entre FGF23, son récepteur et Klotho et la phosphorylation de substrats seront étudiées par immunoprécipitation et par western blot selon des procédures classiques. La production d'animaux génétiquement modifiés par insertion ciblée (knock in) de mutations de NPT2a, de NHERF1 et de FGF23 sera réalisée.//Les anomalies constitutionnelles du transport rénal de phosphate et de sa régulation sont un ensemble large dont la traduction phénotypique est univoque. Ces anomalies se révèlent à l'âge adulte et sont responsables de lithiases rénales et de déminéralisation osseuse, deux cadres pathologiques dont l'incidence est élevée. La dissection moléculaire des anomalies rénales du transport de phosphate est le prélude à la mise en oeuvre de stratégies diagnostiques et thérapeutiques spécifiques visant la régulation d'expression des transporteurs et le système de signalisation FGF23-Klotho