Les mécanismes de l¿action régulatrice des co-transporteurs potassium-chlore dans la formation des réseaux neuronaux – KCC2 and development

Le développement des réseaux neuronaux est associé à des modifications importantes et abruptes dans l'expression et la fonction des canaux et transporteurs ioniques contrôlant l'activité neuronale. Une des molécules clef impliquée dans la régulation de l'activité neuronale est le co-transporteur potassium-chlore KCC2. Ce transporteur, essentiel dans la régulation de la concentration intracellulaire de chlore, apparaît progressivement au cours du développement et est responsable de la transition d'une action excitatrice vers inhibitrice du GABA. Nos travaux récents montrent que KCC2 n'est pas uniquement impliquée dans l'homéostasie chlore, mais qu'elle joue un rôle crucial et actif dans l'établissement et la maturation fonctionnelle de synapses GABAergiques. Le but ce projet est d'étudier en détail le rôle de KCC2 dans la formation et le développement des réseaux neuronaux, et de déterminer les mécanismes impliqués dans ce processus. //Le projet comporte deux parties complémentaires. Dans une première partie, nous étudierons in vitro et in vivo les conséquences de la surexpression ou de la suppression de KCC2 sur le développement neuronal, la formation de synapses et l'activité synaptique neuronale. Dans une seconde partie, nous étudierons les mécanismes par lesquels KCC2 influence le développement neuronal.
Pour étudier le rôle de KCC2 dans le développement neuronal, nous proposons de développer une approche multidisciplinaire (combinant l'électrophysiologie, l'imagerie et la morphologie) sur des préparations ex vivo (hippocampes intacts et tranches) issues d'animaux dans lesquels l'expression de KCC2 a été modifiée in vivo. Les neurones hippocampiques seront transfectés (électroporation à E16) ou infectés (lentivirus à P0) pour surexprimer (introduction d'un ADN codant pour KCC2-GFP) ou sousexprimer (introduction d'un siRNA spécifique de KCC2) KCC2. L'efficacité des différentes constructions (ADN KCC2-GFP et siRNA) sera préalablement validée sur des cultures neuronales. Les animaux seront sacrifiés à 5 et 15 jours de vie postnatale pour analyser les propriétés des neurones et du réseau hippocampique.
Différents mécanismes peuvent être envisagés pour rendre compte de l'action régulatrice de KCC2 sur le développement neuronal : une modification de l'excitabilité neuronale, une modification de [Cl-]i, ou une interaction directe de KCC2 avec des protéines intracellulaires capable de déclencher l'activation d'une cascade cellulaire. Pour tester ces hypothèses, nous proposons de surexprimer d'autres molécules: le canal potassique Kir7.1 pour réduire l'excitabilité neuronale ; le canal chlore ClC2 et le co-transporteur KCC3 pour réduire [Cl-]i, et le co-transporteur NKCC1 pour augmenter [Cl-]i. Pour tester l'hypothèse d'une interaction protéine-protéine, nous proposons d'étudier les effets de protéines chimériques composées de fragments de KCC2 et KCC3.
//1. Notre 1ier objectif sera de déterminer le rôle de KCC2 dans la construction du réseau neuronal hippocampique. Le résultat attendu est d'une part confirmer le rôle de KCC2 dans la maturation des synapses GABAergiques in vivo, et d'autre part étendre la contribution de KCC2 aux synapses glutamatergiques. Cette étude permettra de mettre en évidence la contribution de nouveaux acteurs dans la formation et le développement des réseaux neuronaux.
2. Notre 2ième objectif sera de déterminer les mécanismes impliqués dans l'action régulatrice de KCC2. Cette étude ouvrira de nouvelles perspectives dans la compréhension des processus nécessaires à l'établissement de réseaux neuronaux fonctionnels.
3. Enfin, ce travail axé sur l'exploration de réseaux neuronaux en développement pourra également avoir des répercutions dans l'étude de pathologies associées à une altération de l'expression ou de l'activité de KCC2, telle que l'épilepsie ou suite à un traumatisme cérébral.