Syndromes de Bernard-Soulier et maladies liées au MYH9 : étude des anomalies plaquettaires et de la thrombopoïèse, et correction par thérapie génique. – Macrothrombopénie

La thrombopoïèse est un processus capable de produire 10e11 plaquettes par jour à partir de cellules souches hématopoïétiques de la moelle par des mécanismes encore mal connus. Deux types de maladies rares congénitales, la maladie de Bernard-Soulier (BSS) et celles liées à MYH9 découlent d'une thrombopoïèse anormale aboutissant à la production de plaquettes de grande taille et en nombre diminué (macrothrombopénie). BSS est due à un défaut du complexe GPIb-V-IX plaquettaire qui assure l'adhésion des plaquettes au sous-endothélium vasculaire et l'ancrage du récepteur au cytosquelette d'actine. Les défauts liés à MYH9 affectent la chaine lourde de la myosine IIA et perturbent la contractilité de l'acto-myosine. Des souris inactivées pour une chaine du complexe GPIb-V-IX et pour MYH9 ont été développées au laboratoire et seront utilisées pour étudier les défauts d'hémostase, plaquettaires et de thrombopoïèse dans ces deux pathologies et pour les corriger par thérapie génique.

//Les lignées de souris ont été établies après inactivation des gènes codant pour la GPIbbeta et MYH9, ce dernier étant un KO conditionnel restreint aux plaquettes. Les premières données confirment les défauts d'ultrastructure des plaquettes et mégacaryocytes et de fonctions plaquettaires des patients et montrent une thrombose diminuée dans des modèles in vitro et in vivo. Le projet s'appuiera sur les modèles murins pour 1) étudier les anomalies de l'hémostase et des plaquettes liées au cytosquelette d'actine et de myosine. La tendance hémorragique sera évaluée dans des modèles d'hémorragie cutanés et viscéraux. Le cytosquelette plaquettaire sera étudié au repos ou après activation par des agonistes ou lors de l'adhésion et les effecteurs associés seront caractérisés par microscopie confocale ou biochimiquement. 2) étudier les défauts de thrombopoièse. Le potentiel hématopoïétique sera étudié en tests clonogéniques. Les mégacaryocytes seront étudiés in situ dans la moelle et la rate et après différentiation en culture à partir de cellules souches. Les cellules de foie foetaux (E13.5) au fort potentiel de prolifération et de production de mégacaryocytes proplaquettogènes seront différentiées en culture liquide. Les marqueurs plaquettaires et les composants du cytosquelette seront visualisés en microscopie confocale et électronique et la maturation (marqueurs et ploïdie) sera suivie par cytométrie en flux. La cinétique de formation des plaquettes à partir de cellules matures en milieu-semi solide sera suivie par microscopie « time-lapse ». 3) évaluer une stratégie de thérapie génique. Le transfert de cellules souches hématopoïétiques sera utilisé pour corriger les défauts de thrombopoièse des souris déficientes en GPIbbeta et MYH9. Les cellules de foie foetal de ces souris seront transduites par des vecteurs lentiviraux codant les gènes normaux et greffées dans les souris adultes irradiées de la même lignée.//Cette étude devrait permettre une meilleure connaissance des mécanismes hémorragiques dans les maladies de Bernard-Soulier et celles liées à MYH9, l'évaluation de traitements par thérapie génique, une meilleure compréhension du rôle des cytosquelettes d'actine et d'actomyosine dans l'architecture des plaquettes et leur réorganisation lors de leur activation, et une caractérisation biochimique des protéines associées au cytosquelette contrôlant la forme des plaquettes. Un résultat important sera d'améliorer nos connaissances sur les mécanismes de la thrombopoïèse, et notamment sur le rôle des protéines du cytosquelette, et de préciser le mécanisme de libération des plaquettes dans la circulation. Ce projet permettra d'acquérir les techniques de culture des mégacaryocytes ouvrant la voie aux manipulations génétiques dans la lignée plaquettaire. Enfin, cette étude validera le concept d'une thérapie génique dans les maladies de Bernard-Soulier et liées à MYH9.