Etudes structure-fonction de la voie de sécrétion protéique à deux partenaires chez les bactéries à Gram négatif: compréhension des mécanismes moléculaires du transport de protéines dans la superfamille TpsB/Omp85 – TPS PATH

Le transport membranaire de protéines est une question biologique fondamentale et un aspect majeur de la pathogénie bactérienne. Chez diverses bactéries pathogènes à Gram négatif, la voie de sécrétion à deux partenaires (TPS) assure la sécrétion de protéines de virulence par leurs transporteurs « TpsB » spécifiques, à travers la membrane externe. Les transporteurs TpsB font partie de la superfamille Omp85/TpsB, dont les membres assurent l'intégration de protéines dans les membranes externes de bactéries, chloroplastes et mitochondries ou le transport de protéines à travers ces membranes. Nous avons obtenu la structure X de FhaC, qui sécrète l'adhésine FHA chez Bordetella pertussis. Nous proposons donc d'utiliser cette structure pour déchiffrer les mécanismes moléculaires du transport de FHA par FhaC. Notre but est d'établir un modèle de la sécrétion de protéines par la voie TPS, et plus largement de jeter les bases de la compréhension moléculaire des autres transporteurs de la famille//FhaC est un monomère qui forme un tonneau beta C-terminal fermé par une hélice alpha N-terminale, H1, et une boucle de surface, L6, portant un motif signature de la superfamille. En amont du tonneau se trouve un module périplasmique formé de deux domaines POTRA en tandem. Nous faisons l'hypothèse que le transport de FHA par FhaC est un processus dynamique impliquant les domaines POTRA et les éléments conservés du tonneau.
Ojectif 1: fonction des domaines de FhaC.
Les sites de FhaC pour la reconnaissance et le transport de FHA seront identifiés par mutagenèse ponctuelle de POTRA1, 2, L6 et de l'intérieur du canal. L'effet des mutations sur la sécrétion de FHA, les interactions FHA-FhaC in vitro et la conductance de FhaC sera determiné. Comme le pore de FhaC semble trop petit pour le passage de FHA, H1 ou L6 devrait(ent) sortir du canal lors de la sécrétion. Nous construirons des variants de FhaC avec ces éléments bloqués dans le pore.
Objectif 2 : améliorer la structure
Pour améliorer la resolution (3.15Å) nous modifierons par mutagenèse des résidus de surface pour de meilleurs contacts dans le cristal.
Objectif 3 : FhaC en action et complexes FhaC-FHA.
Un (des) complexe(s) de FhaC en interaction avec des peptides de FHA sera(ont) cristallisé pour étudier la reconnaissance des 2 protéines. Nous tenterons aussi d'obtenir in vivo et de cristalliser un complexe entre FhaC et une chimère bloquée dans le pore grâce à l'addition d'un domaine globulaire à un dérivé de FHA.
Objectif 4 : repliement de FHA
Un chaperon/protease périplasmique, DegP est requis pour la sécrétion de FHA par B. pertussis, probablement parce que cette protéine empêche l'aggrégation ou le mauvais repliement de FHA dans le périplasme. Les interactions entre FHA et DegP seront analysées in vitro par coprécipitation, filtration sur gel and diffusion de lumière. Enfin, le rôle de FhaC pour aider au repliement de FHA en cours de sécrétion sera analysé. //La combinaison de mutagenèse basée sur la structure avec la cristallographie et des explorations fonctionnelles nous permettront de déchiffrer les mécanismes moléculaires de la sécrétion de FHA par FhaC, y compris les étapes de reconnaissance, transport et repliement. Nous pourrons ainsi proposer un modèle applicable à tous les systèmes TPS. En plus de contribuer à la compréhension fondamentale de la sécrétion de protéines chez les bactéries, ce travail pourrait aider à identifier de nouvelles thérapies anti-microbiennes, puisque ces systèmes sont présents chez de nombreux pathogènes.
Nos investigations de FhaC éclaireront aussi sur le rôle des domaines POTRA et autres motifs conservés de la superfamille. En particulier, nos progrès sur le mécanisme et la dynamique de FhaC seront vraisemblablement pertinents pour ces autres transporteurs, dont certains sont des protéines procaryotes et eucaryotes essentielles, assurant la biogenèse de protéines des membranes externes.