Bases moléculaires et structurales de l'activation du récepteur Toll au cours de la réponse immunitaire innée chez la drosophile – TOLL ACTIV STRUCT

L'immunité innée a pour base la reconnaissance de motifs spécifiques comme les peptidoglycanes ou les beta1-3 glucanes à la surface des microorganismes. De nombreuses études génétiques conduites chez la drosophile ont permis de mettre en évidence la voie Toll responsable de l'activation de la synthèse de peptides antimicrobiens. Les gènes essentiels pour la reconnaissance (PGRPs et GNBPs) et la transmission du signal extracellulaire (protéases) ont été décrits récemment. Cependant peu d'études au niveau moléculaire et structural ont été conduites jusqu'à présent. L'objectif du projet est de comprendre les mécanismes moléculaires de la reconnaissance, le fonctionnement des cascades de signalisation et en final les liens entre ces deux événements. Le décryptage des mécanismes moléculaires responsables de l'activation du récepteur Toll chez la drosophile contribuera à la compréhension de mécanismes proches chez les mammifères.//Notre projet cible les protéines extracellulaires en amont de Toll. La détection de bactéries Gram positive est réalisée par les PRR (pattern Recognition Receptor) PGRP-S2, GNBP1 et PGRP-SD alors que GNBP3 décèle les champignons. La reconnaissance des microorganismes par les PRR déclenche une cascade de protéases qui aboutit à l'activation de Toll. Notre but est de déchiffrer les mécanismes structuraux de la reconnaissance et d'expliquer comment celle-ci active la première protéase de la cascade. Il sera donc nécessaire de caractériser les protéases et notamment leur régulation.
La première étape du projet est de fournir des informations moléculaires et structurales sur toutes les protéines ciblées. Ceci sera accompli en produisant des protéines recombinantes solubles et fonctionnelles en utilisant le système d'expression en cellule S2. Pour chaque protéine, la masse moléculaire, la stabilité et le repliement correct seront évalués par spectrométrie de masse, DLS (dynamic light scattering) et dichroïsme circulaire. Puis les protéines seront cristallisées et leur structure sera résolue par cristallographie des
rayons X. En parallèle, leurs fonctions seront évaluées par des études fonctionnelles in vivo utilisant des lignées mutantes de drosophile déficientes pour les gènes correspondants. La seconde étape consistera à collecter des informations sur les interactions protéine-protéine. Dans une première approche, des expériences de co-immunoprécipitation seront réalisées puis les études seront affinées en utilisant la technique de résonance plasmonique de surface. Ces informations serviront à établir le réseau d'interactions nécessaires pour relier la reconnaissance à l'activation du récepteur Toll. Finalement ce réseau sera confirmé en reconstituant in vitro la totalité de la voie à l'aide de protéines recombinantes.
//Toutes les protéines impliquées dans l'activation de la voie Toll seront clonées pour l'expression dans le système de cellule S2 de drosophile. Leur production en grandes quantités permettra leur caractérisation en termes de stabilité, d'état d'oligomérisation et de propriétés enzymatiques. Leurs fonctions seront évaluées par des études fonctionnelles in vitro et in vivo en utilisant des protéines recombinantes.
L'objectif à moyen terme est de déterminer la structure cristallographique d'au moins un membre de chaque famille. Ceci permettra d'élucider les mécanismes structuraux de la reconnaissance et de définir les cascades protéolytiques.
L'objectif à long terme est de déchiffrer les interactions protéine-protéine nécessaires pour relier la reconnaissance à l'activation du récepteur Toll. L'objectif ultime est de reconstituer in vitro les voies menant de la reconnaissance de bactéries ou de champignons au clivage de spaetzle à l'aide de protéines recombinantes.