– Refolding GPCRs

En dépit du rôle-clef qu'elles jouent dans la physiologie cellulaire, les bases moléculaires de la fonction comme du dysfonctionnement des protéines membranaires (PMs) sont rarement connues avec précision. L'un des principaux obstacles à l'établissement de la structure des PMs est leur faible abondance naturelle et la difficulté que présente leur surexpression sous forme fonctionnelle. De grandes quantités de PMs peuvent être obtenues sous forme dénaturée à partir de corps d'inclusion, mais leur renaturation reste le plus souvent impraticable. L'un des principaux obstacles rencontrés lors de ces tentatives est le caractère inactivant des détergents utilisés pour maintenir les PMs hydrosolubles, qui rend extrêmement difficile la mise au point de conditions permettant à la PM de se renaturer tout en l'empêchant d'agréger. Nous avons récemment établi qu'il est possible de contourner cet obstacle grâce à l'utilisation d' amphipols (petits polymères amphiphiles), dont le principe a été conçu et la structure et l'utilisation en biochimie mises au point dans l'un de nos laboratoires. Des résultats obtenus sur six PMs - trois protéines modèles et trois récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) -, montrent en effet que les amphipols constituent un milieu remarquablement favorable pour leur renaturation. Nous nous proposons d'étendre ces observations à un groupe élargi de GPCRs-cibles en vue d'identifier les jeux de conditions les plus favorables à leur repliement, d'en analyser les mécanismes sous-jacents, de mettre ainsi au point une nouvelle approche générale pour la renaturation des PMs, et de l'appliquer à un certain nombre de GPCRs, produits en masse mais dont la renaturation est jusqu'à présent restée impossible, afin de les rendre accessibles aux études fonctionnelles et structurales. - Le projet associe quatre laboratoires dont l'expertise est bien établie dans les domaines de la conception et la synthèse des amphipols, de leurs applications à l'étude des PMs, de la surexpression de celles-ci, GPCRs en particulier, de leur renaturation, et de leur étude structurale par diffraction des rayons X et RMN. Trois étapes chevauchantes sont prévues, de difficulté croissante : a) optimisation du choix et des conditions d'utilisation des amphipols à l'aide de PMs modèles ; b) extension à des GPCRs ayant déjà été partiellement ou totalement renaturés ; c) application à des GPCRs dont la renaturation est jusqu'à présent restée impraticable. Après addition d'amphipols, la renaturation sera initiée en abaissant la concentration des agents dénaturants et suivie par des méthodes spectroscopiques et/ou de liaison de ligands. Les paramètres étudiés incluront la nature et la concentration des partenaires, la température, le pH, la force ionique, l'état éventuel de repliement partiel de la protéine dénaturée, la nature et la vitesse d'élimination du ou des agents dénaturants, l'addition de cofacteurs (lipides...), etc. Chaque fois que cela sera techniquement possible, l'influence de ces paramètres sur la cinétique et non seulement le rendement final de la renaturation sera examinée. De nouveaux amphipols seront conçus, synthétisés et testés en vue de cette application. Des séries de GPCRs homologues seront surexprimées et leur renaturation testée, afin d'examiner la généralité des procédures développées et d'accroître le nombre de cibles renaturées avec succès. La fonctionnalité, la structure, la dispersité et la stabilité des récepteurs ainsi renaturés seront analysées et, lorsque la qualité des préparations le permettra, ils seront étudiés par RMN et/ou diffraction des rayons X. - ...