Réparation des cassures double brin de l'ADN chez les mammifères: mécanismes alternatifs au NHEJ; signalisation cellulaire – NHEJ-alt/AKT1

La cassure double brin (CDB) de l'ADN est une lésion létale majeure qui peut aussi conduire des réarrangements génétiques. Ceux-ci peuvent générer de la diversité génétique ou être à l'origine d'instabilité génétique. La régulation précise de la réparation des CDB est donc essentielle pour contrôler l'équilibre entre stabilité et diversité génétique. Deux voix générales assurent la réparation des CDB : la recombinaison homologue (RH) et la ligature d'extrémités non homologues (NHEJ pour Non Homologous End joining). Le NHEJ « canonique » implique l'intervention successive de l'hétérodimère KU80/KU70, DNA-PK-Artemis, et de la ligase4 associée à ses cofacteurs. Cependant des systèmes de NHEJ indépendants de KU (Ku-alt) ou de XRCC4 (XRCC4-alt) ont été décrits. Enfin, l'invalidation de XRCC4 aboutit à des phénotypes plus sévères que l'invalidation de KU, suggérant que XRCC4 puisse agir dans plus de voies métaboliques que KU. Ceci souligne la complexité de la situation. Les relations entre le NHEJ et les voies alternatives de réparation des CDB (RH ainsi que NHEJ-alt) doivent donc être étroitement contrôlées; la signalisation doit donc être précise et efficace. - Deux axes complémentaires constituent notre projet : - 1- La caractérisation moléculaire du NHEJ-alt, dans un contexte intrachromosomique, dans des cellules vivantes. - 2- L'impact de la voie de signalisation AKT1 sur le NHEJ et le NHEJ-alt. - - 1. Caractérisation du NHEJ-alt chez les mammifères. - Nous avons développé des substrats permettant de mesurer le NHEJ à un niveau moléculaire précis, dans un contexte intrachromosomique en cellules vivantes. En utilisant ces substrats nous avons montré que le défaut de KU80 affecte marginalement l'efficacité de NHEJ mais diminue fortement la fidélité un NHEJ. Au contraire de KU, le défaut de XRCC4 affecte fortement l'efficacité de NHEJ. Cependant une voie alternative (XRCC4-alt) existe mais est très mutagène. Ces données sont en accord avec les modèles transgéniques murins qui montrent i) que l'invalidation de XRCC4 conduit à des phénotypes plus sévères que celle de KU ; ii) une grande instabilité génétique dans les souris invalidées pour la ligase IV. Dans les deux cas (mutation KU ou mutation XRCC4), les données suggèrent un modèle pour le NHEJ-alt. Les différentes étapes de ce modèle nous permettent de proposer des gènes candidats (déduits de la littérature) pour le contrôle de ces étapes donc du NHEJ-alt. Nous proposons de les tester en analysant l'impact de leur extinction (siRNA) sur l'efficacité et la fidélité du NHEJ, en utilisant nos substrats, donc dans un contexte intrachromosomique. Les gènes candidats sont MRE11 pour la première étape (résection simple brin), ERCC1 et MSH2 (pour la résolution des intermédiaires « branchés »), PARP et XRCC1 pour la dernière étape (réparation de la brèche simple brin). - - 2. La signalisation par AKT1. - Des mutations germinales de gènes impliqués dans la réponse aux dommages à l'ADN sont responsables des cancers du seins héréditaires. Cependant la majorité des cas de cancer du sein sont des cas sporadiques. La kinase oncogénique AKT1 est surexprimée ou activée dans 30 à 50% des cancers du sein sporadiques. Nous avons donc posé la question : AKT1 affecte t-elle la réponse aux dommages à l'ADN ? - AKT1 est impliquée dans la réponse, de la voie membranaire PI3-kinase, aux facteurs extracellulaires (hormones, facteurs de croissance...) qui régule le métabolisme, le cycle cellulaire et l'apoptose. Nous avons montré qu'AKT1 constitutivement activée conduisait à une rétention de BRCA1 et RAD51 dans le cytoplasme et à une inhibition de la RH. Cette situation a été retrouvée dans 50% des cancers du sein sporadiques que nous avons analysé. La rétention cytoplasmique de BRCA1 et RAD51 requiert la protéine FOXO1a dans un rôle de type chaperonne, suggérant l'existence d'un complexe cytoplasmique contenant au moins FOXO1a, BRCA1 et RAD51, lorsque AKT1 est activée. - Comme BRCA1 est aussi