Synthèses biocatalysées innovantes d'haptènes glycofuranosidiques – FURAZYME

Certains glycoconjugués sont constitués d'entités hexoses et/ou pentoses dans une configuration furanosidique rare. Ces molécules complexes se retrouvent notamment chez les plantes ou sont encore biosynthétisées par des organismes tels que des bactéries, des parasites ou des champignons microscopiques. Cependant, leurs rôles biologiques ne sont pas encore clairement élucidés mais il semble que des structures hexofuranosidiques soient impliquées en tant qu'épitopes dans des biomolécules produites par des micro-organismes hautement pathogènes provoquant des maladies graves (tuberculose, lèpre, leishmanioses, ...). D'autre part, à notre connaissance, les cellules de mammifères en sont exemptes. Ces glycofuranoconjugués constituent donc des cibles moléculaires de choix pour la conception de nouvelles molécules bioactives susceptibles notamment d'être impliquées dans des vaccins glycosidiques ou possédant des activités immunomodulatrices. Parmi les oligofuranosides produits par des micro-organismes tels que Trypanosoma, Aspergillus ou encore Leishmania, le D-galactose est le plus répandu et est souvent lié à la position 3 d'entités furanosidiques ou pyranosidiques. Par ailleurs, son homologue 6-désoxy (D-fucose) a également été mis en évidence dans des produits naturels. Dans ce contexte, des méthodes de synthèse chimique spécifiques aux hexofuranosides ont été développées au cours de la dernière décennie. En parallèle, des approches chimio-enzymatiques sont apparues dans le domaine des pyranosides. De manière surprenante, il existe très peu de développement de méthodes visant à préparer des furanosides utilisant des enzymes. Récemment, nous avons publié nos premiers résultats dans le domaine pour la synthèse de difuranosides biocatalysée par l'AbfD3, une alpha-(1,2)-arabinofuranosidase recombinante. Dans ce contexte, nous proposons maintenant de développer de nouvelles approches chimio-enzymatiques d'oligosaccharides de type beta-D-Galf-like-(1,3)-D-Pyranoside. Nos objectifs consistent donc en : - la synthèse d'enchaînements furanoside-pyranoside assistée par des hydrolases reconnaissant spécifiquement les entités furanosyle ; - la préparation et l'utilisation de nouvelles protéines afin d'accroître l'efficacité de l'enzyme sauvage pour la création de nouvelles liaisons glycosidiques beta-(1,3). Ayant défini nos cibles moléculaires, nous avons d'ores et déjà initié cette étude et identifié une enzyme, l'Araf51, susceptible d'hydrolyser des liaisons alpha-(1,3)-arabinofuranosidiques. Il s'agit d'une des deux arabinofuranosidases de la famille 51 dont la structure tridimensionnelle a été établie par rayons X. Nous avons alors reçu de la part du Prof G. DAVIES, l'un des auteurs de la publication concernant la caractérisation de l'Araf51, deux plasmides, l'un correspondant à l'enzyme sauvage et l'autre à un mutant nucléophile. Sur cette base, notre programme comporte donc cinq phases intimement liées : - synthèse chimique de donneurs de furanosyle et de composés désoxy et/ou fluorés dérivés de galactofuranosides ; - production et purification de protéines (sauvage et mutantes) ; - étude des relations structure-activité via la détermination des paramètres cinétiques et l'utilisation des enzymes dans des réactions d'auto-condensation et de transglycosylation ; - adaptation de l'approche de Whiters dans le cas des furanosides. Ceci impliquera le développement de méthodes d'activation in situ puisque les fluorures de furanosyle sont réputés pour leur instabilité intrinsèque. Cette activation dans le site actif de l'enzyme a pour objectif de conduire à un produit mimant l'intermédiaire glycosyl-enzyme afin qu'il soit consommé au plus vite ; - production de nouveaux biocatalyseurs adaptés aux donneurs souhaités (L-Araf vs. D-Fucf vs. D-Galf) et, le cas échéant, aux accepteurs (D-Glcp vs. D-Galp vs. D-Manp). Ce projet repose donc sur notre expertise en synthèse de dérivés glycofuranosidiques et vise à enrichir les approches chimiques par des