Etablissement et dynamique de sous-compartiments nucléaires répressifs pour la transcription chez S. cerevisiae – Epi Noyau

1. Contexte scientifique et objectifs du projet Le génome, dans le noyau des cellules eucaryotes, est organisé dans l'espace sous la forme d'un complexe nucléoprotéique : la chromatine. Cette organisation permet, non seulement de compacter l'ADN, mais aussi, de réguler des interactions avec l'ADN au cours de son métabolisme. L'unité de base de cette organisation est le nuclésome, au delà duquel la chromatine adopte des niveaux de compaction supérieurs qui définissent des domaines nucléaires spécialisés. En particulier, les régions d'hétérochromatine forment des domaines répressifs pour la transcription des gènes 1. Bien que les mécanismes d'extinction des gènes aient divergés au cours de l'évolution, le regroupement de séquences répétées formant des sous-compartiments répressifs pour la transcription semble être un thème récurrent. Comment des compartiments sub-nucléaires spécialisés se mettent en place et sont maintenus au travers des divisions cellulaires ? Ces mécanismes sont encore mal connus et font l'objet de ce projet. Nous avons choisi d'étudier, comme modèles de compartiments sub-nucléaires fonctionnels, les foyers formés par le regroupement des télomères chez S. cerevisiae, en couplant la génétique de la levure à des approches de microscopie in vivo avancées. Chez la levure, les 32 télomères d'une cellule haploïde sont regroupés en 3 à 4 foyers principalement localisés à proximité de l'enveloppe nucléaire, créant des compartiments subnucléaires répressifs pour la transcription, dans lesquels les protéines Sirs sont concentrées. Les protéines Sir2, Sir3 et Sir4 forment un complexe recruté aux télomères par des protéines qui lient directement l'ADN, dont Rap1 qui lie les répétitions TG télomériques, et l'hétérodimère Ku (yKu70/yKu80) qui se fixe aux extrémités des chromosomes. Une fois recruté, le complexe Sir2/3/4 se propage en se liant aux extrémités non acétylées des histones, provoquant ainsi la répression, ou silencing, des gènes adjacents1. Ici, nous proposons de mettre en place un système expérimental permettant de suivre l'établissement de ces foyers. 2. Méthodologie Les télomères pourront être visualisés grâce à l'expression d'une forme étiquetée à la GFP de la protéine télomérique Rap1. La protéine Sir3, qui est essentielle à la formation des foyers, sera exprimée sous le contrôle d'un promoteur inductible. L'induction de la protéine Sir3 permettra de suivre : - la formation des foyers télomériques en microscopie in vivo - l'établissement du silencing en mesurant la quantité de transcrits de gènes soumis au silencing par transcritpion reverse quantitative (qRT-PCR) - l'association et la propagation des protéines Sirs par immuno-précipitation de chromatine (ChIP) - la dynamique de loci chromatiniens (étiquetés par l'insertion d'opérateurs Lac et l'expression de la fusion lac-mRFP) par rapport aux foyers télomériques (Rap1-GFP) par microscopie 2 couleurs in vivo. 3. résultats attendus Phase1 : Comment et quand sont établis les foyers télomériques ? Une souche exprimant Rap1-GFP dans laquelle Sir3 est inductible par le galactose et portant un gène rapporteur dans une région subtélomérique a déjà été générée et les résultats préliminaires sont vraiment prometteurs. Ce système devrait nous permettre de répondre aux questions suivantes : - quel est l'ordre des évènements : le silencing est-il établi avant ou après la formation des foyers ? - quelle est l'influence du cycle cellulaire ? - quelle est la dynamique d'un télomère au cours de l'établissement des foyers télomériques et du silencing ? Phase 2 : Mécanismes et relation fonctionnelle avec le silencing Une fois obtenu une image détaillée de la façon dont les foyers télomériques sont établis, nous pourrons disséquer les mécanismes à l'œuvre au cours de ce processus en couplant une approche génétique à notre système expérimental. Nous essaierons de répondre aux questions suivantes : quels sont les déterminants de l'organisation des télomères en foyers et comment celle-ci influence-t-elle l'expression des gènes ? Nous envisageons d'interférer avec la formation des foyers télomériques à différents niveaux de ces structures : a) l'ancrage des télomères à l'enveloppe nucléaire, b) la stoechiométrie des protéines Sir, c) l'assemblage des nucléosomes et les modifications des histones. Perspectives Ce système expérimental pourra également être utilisé pour étudier la maintenance des foyers télomériques en utilisant des mutants conditionnels de composants de la chromatine télomérique. Nous pensons que cette approche permettra d'élucider certains mécanismes impliqués dans l'assemblage de compartiments sub-nucléaires spécialisés et leur importance pour l'expression des gènes. Nous espérons découvrir des principes généraux de l'auto-organisation de sous-compartiments. A terme, la conservation de ces mécanismes chez les eucaryotes supérieurs pourra être testée en collaboration avec d'autres équipes de l'UMR218.