Biogenèse et Dynamique d'assemblage des Métalloprotéines. – BIODYNMET

Les métaux interviennent dans de nombreux processus biologiques. Ils peuvent être essentiels au métabolisme cellulaire ou encore nécessaire à l'intégrité physique de certains constituants des parois cellulaires. A contrario, les métaux sont responsables de stress cellulaire ou impliqués dans de nombreuses pathologies humaines. Ainsi, il est communément admis que les espèces actives de l'oxygène (dites EAO) produites en conditions de stress oxydant, jouent un rôle-clé dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer. Enfin, il existe un lien bien établi entre les métaux et les EAO car la plupart des enzymes qui produisent des EAO ou réagissent avec eux sont des métalloprotéines contenant des métaux oxydants-réducteurs tels que le cuivre ou le fer. Environ un tiers des protéines contiennent un cofacteur métallique et la majorité d'entre elles sont des métalloenzymes essentielles. Chez tous les organismes vivants, les métalloenzymes sont impliquées dans des processus biocatalytiques fondamentaux comme la fixation de l'azote, le stockage de l'oxygène et son utilisation ou bien encore la dégradation de métabolites ou de xénobiotiques. Les métalloenzymes sont souvent présentes sous la forme de complexes multimériques et peuvent posséder divers centres métalliques. Ces derniers sont généralement enfouis au cœur des protéines. La mise en place et la stabilité de ces assemblages nécessitent une dépense énergétique qu'il s'agit de contrôler et de minimiser. Comprendre quand et comment doivent être réalisés l'insertion du ou des centres métalliques et l'assemblage des sous unités pour assurer la synthèse optimale d'un complexe actif est donc fondamental. Il est cependant vraisemblable que ces deux événements soient couplés et/ou coordonnés. Dans les bactéries à gram négatif, un niveau supplémentaire de complexité est atteint lorsque l'enzyme nécessite d'être adressée dans un autre compartiment cellulaire. Le transport de l'enzyme est alors effectué par le système de translocation Tat dédié au transport de molécules repliées à travers la membrane cytoplasmique. Dans le cas de métalloenzymes multimériques, un système de contrôle encore mal caractérisé assurerait l'adressage à la machinerie de translocation d'une enzyme correctement repliée et ayant ses centres métalliques. L'objectif de ce projet consiste donc à comprendre les aspects dynamiques et moléculaires d'un phénomène biologique universel, la biogenèse des métalloprotéines. Pour cela, un complexe respiratoire membranaire modèle, la nitrate réductase A chez Escherichia coli, servira de système d'étude. En parallèle, une étude comparative sera réalisée sur un complexe multimérique similaire mais localisé dans le périplasme, le complexe formiate deshydrogènase N. Une approche intégrée combinant la biologie moléculaire, la biochimie, l'étude des interactions protéine-protéine et des études physico-chimiques et structurales (RPE et RMN) sera utilisée. D'ores et déjà, nous avons montré dans le cas du complexe nitrate réductase A que la protéine accessoire NarJ coordonne l'insertion des centres métalliques à l'assemblage du complexe multimérique. Le projet consistera dans un premier temps à (i) comprendre de quelle manière NarJ contrôle la biogenèse du complexe nitrate réductase (identification des sites d'interaction sur l'apoenzyme ; influence de NarJ sur l'insertion des différents centres métalliques) et (ii) déterminer la structure de NarJ par RMN. Dans un deuxième temps, l'étude portera sur le complexe périplasmique formiate deshydrogènase N dont la maturation fait intervenir deux protéines accessoires, FdhD et FdhE. Le mode d'action de ces protéines sera étudié par une approche comparable à celle employée pour NarJ. Enfin, les relations que ces protéines ont avec la machinerie de biosynthèse des centres [Fe-S] seront analysées dans le contexte de biogenèse d'un complexe multimérique à plusieurs centres métalliques. La comparaison des deux complexes enzym..