– Pol2Kinetics

Nos travaux récents nous permettent de comprendre les différentes étapes successives qu'entreprend l'ARN polymérase II (pol II) pour transcrire un gène spécifique dans une cellule vivante. Nous nous appuyons sur des lignées cellulaires établies pour l'analyse du recrutement de la machinerie pol II sur des gènes particuliers et dans des cellules vivantes (revues dans : Darzacq et al 2005 Curr. Opin. Cell. Biol., Shav-Tal et al 2004 Nat Rev Mol Cell Biol.). Nous avons déjà utilisé cette technologie pour comprendre le recrutement co-transcriptionnel des protéines nécessaires à la biogenèse d'une famille de petits ARN (Darzacq et al, J. Cell. Biol. Sous presse). Nos méthodologies expérimentales sont basées sur la quantification de molécules fluorescentes génétiquement codées dans des cellules uniques et vivantes. Les valeurs que nous sommes capables d'enregistrer sont analysées en utilisant des outils de simulation mathématiques basés sur la résolution de systèmes d'équations différentielles. Ces travaux nous ont permis de proposer un modèle pour la transcription d'un gène artificiel contrôlé par l'activateur transcriptionnel VP16. Nous montrons qu'il existe trois populations différentes d'ARN Pol II recrutés sur ce gène avec des cinétiques distinctes. Nous définissons les différents flux de matière qui connectent ces différentes populations nous permettant ainsi d'apporter la première mesure in vivo des processus de liaison et d'initiation de la Pol II sur un gène particulier. Nous montrons ainsi que la majeure partie des molécules d'ARN pol II recrutées sur ce gène seront rapidement libérées soit après avoir contactées de manière très courte le promoteur soit suite au processus d'initiation abortive. Nous quantifions le nombre de polymérases capables de produire un ARN messager (ARNm) comme étant un événement rare résultant du recrutement actif de plusieurs dizaines de molécules au niveau des séquences régulatrices du promoteur. Nous avons également développé des technologies nous permettant de marquer spécifiquement les polymerases engagées dans l'élongation en marquant spécifiquement leur ARN naissant par le système MS2 (shav-Tal et al 2004 Science). Cette technique nous permet de quantifier la vitesse de polymérisation de cette enzyme ainsi que de mesurer son temps global de pause (Darzacq et al, en cours de publication). Ces résultats nous permettent de comprendre comment les différents paramètres cinétiques que nous sommes capables de mesurer peuvent influencer le mode de production d'ARNm par des gènes particuliers. A l'heure actuelle, nous connaissons un grand nombre de facteurs permettant la mise en place de la machinerie transcriptionelle sur un gène. Finalement, bien qu'il soit établi que la machinerie transcriptionelle recrutée par un promoteur est différente en fonction de l'état de la cellule ainsi que de la nature du gène transcrit, nous ne comprenons pas encore comment ces différences se traduisent sur l'activité transcriptionelle de ces assemblages. Ici nous proposons d'analyser l'activité transcriptionelle de l'ARN pol II en résolvant 4 paramètres différents (liaison, initiation, élongation et pause) en fonction du type d'activateur transcriptionnel mis en place. Cette analyse sera conduite en utilisant principalement les techniques d'analyse d'image que nous avons décrites. Nous avons déjà entamé un projet visant à comprendre les implications cinétiques du mode de régulation du promoteur HIV. En effet, la transcription rétrovirale présente la particularité de détourner un facteur d'élongation cellulaire central qui est le p-TEFb. Ainsi il semble que cette transcription rétrovirale puisse échapper aux régulations transcriptionelles globales cellulaires. Ce projet outre son importance dans la compréhension de l'activité rétrovirale constitue un exemple de régulation particulière et nous chercherons à déterminer si des gènes cellulaires utilisent des mécanismes de régulation similaires afin de s'adapter à des situations précises. Notre capacité à résoudre les aspects cinétiques de la transcription par modélisation mathématique nous permet également d'interpréter différents résultats biochimiques, par exemple, la répartition des ARN POL II sur différents gènes sera analysée par immunoprecipitation de chromatine suivie d'analyse par puces à ADN. Nous établirons ici une puce sur laquelle seront déposés les séquences de plusieurs gènes modèles ainsi que les gènes artificiels que nous introduisons dans les lignées cellulaires ce qui nous permettra de corréler la position des polymérases dans les différentes régions de ces gènes avec leur cinétique observée dans la cellule vivante. Cette méthodologie sera appliquée à différents facteurs en fonction de traitements pharmacologiques par des inhibiteurs spécifiques de composants de la machinerie transcriptionelle.