Conception rationnelle de nouveaux agonistes du PACAP et études de leurs effets neuroprotecteurs – ENAPACAP

Le pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) est un peptide qui exerce de nombreuses activités neuroprotectrices via le récepteur spécifique PAC1. En particulier, il a été montré que le PACAP protège les neurones en culture de la toxicité induite par un stress oxydatif, l'éthanol ou le LPS. Suite à une ischémie cérébrale, l'administration iv de PACAP réduit considérablement la zone infarcie même lorsque le peptide est injecté plusieurs heures après le choc ischémique. Néanmoins, du fait de sa faible biodisponibilité et de sa demi-vie très courte, le PACAP ne peut être utilisé en clinique. En revanche, les effets neuroprotecteurs du PACAP indiquent que des dérivés plus stables et sélectifs du récepteur PAC1 pourraient constituer le point de départ pour le développement de nouveaux traitements. Nos objectifs sont donc de développer et caractériser des dérivés du PACAP, d'étudier les effets neuroprotecteurs de ces analogues dans des modèles de neurodégénérescence, de déterminer les mécanismes mis en jeu dans les effets neuroprotecteurs du PACAP et de ses analogues, et de rechercher si les effets du PACAP observés chez le rat sont retrouvés chez le primate pour envisager des applications thérapeutiques. 1- Nous avons synthétisé une série d'analogues du PACAP et il s'avère que l'incorporation d'un groupement acétyl au niveau de la fonction N-terminale ou l'inversion de chiralité en position 2 confère au peptide une excellente résistance à l'action de la dipeptidyl peptidase IV (DPP IV), principale enzyme impliquée dans la dégradation du PACAP. De plus, des résultats préliminaires indiquent que plusieurs des peptides synthétisés gardent la même efficacité que le PACAP à induire la différenciation des cellules PC12. Nous avons aussi mis en évidence l'existence d'un site de clivage du PACAP38 par des endopeptidases en position 21 dans le plasma. Ainsi, l'analogue [CH2 NH21 22]PACAP38 présente une stabilité plasmatique nettement supérieure à celle du peptide natif. La spécificité et l'affinité de ces nouveaux analogues vont être testées sur des cellules exprimant individuellement chacun des 3 sous-types de récepteurs du PACAP et nous mesurerons l'effet neurotrophique de ces analogues sur des neurones en culture primaire. Cette étude sera complétée par des analyses de dichroïsme circulaire et spectroscopie RMN pour déterminer la structure des différents fragments N-terminaux actifs. Les résultats nous permettront alors de concevoir d'autres analogues spécifiques du récepteur PAC1 ayant une excellente efficacité et une bonne stabilité. L'activité neuroprotectrice des analogues synthétisés sera aussi évaluée sur des cellules en grain du cervelet de rat en culture. 2- Afin de mettre en évidence in vivo les effets neuroprotecteurs des analogues synthétisés, nous utiliserons deux modèles. Nous administrerons les analogues du PACAP d'une part à des rats ayant subi une ischémie cérébrale transitoire et d'autre part à des ratons alcoolisés. En fonction du modèle utilisé, nous évaluerons ensuite les effets des agonistes du PACAP sur le volume de l'infarctus, l'activité des caspases, l'expression de gènes antiapoptotiques ou l'activité motrice des animaux. Nous étudierons aussi l'effet des analogues du PACAP sur plusieurs paramètres physiologiques dont la pression artérielle et la température corporelle qui représentent des indicateurs importants de l'évolution de l'infarctus cérébral. Enfin, nous caractériserons dans nos deux modèles d'études certaines protéines régulées par le PACAP pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. 3- Nous tenterons de transposer chez le primate une partie des résultats obtenus chez le rongeur. Grâce à une collaboration établie avec le CIT, une entreprise de Haute-Normandie qui possède l'une des plus grandes animaleries primates de France, nous effectuons avec le PACAP et les analogues synthétisés des expériences de radioliaison et des études fonctionnelles (expression du gène bcl-2, activi