Lipolyse et pathogénicité bactérienne chez Mycobacterium tuberculosis – LipoMYCO

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) et Mycobacterium leprae (M. leprae) qui sont les deux agents pathogènes responsables de la tuberculose et de la lèpre, respectivement, appartiennent à la famille des Actinomycètes et sont très proches génétiquement. La tuberculose est une des maladies infectieuses les plus meurtrières avec environ 2 millions de morts par an. Le bacille de la tuberculose est capable de rentrer en phase de latence en formant des structures appelées granulomes contenant des lipides des cellules hôtes infectées. Les traitements actuels sont peu efficaces contre ces bacilles persistants et ces formes de latences peuvent se réactiver des années après la primo infection. Les lipases ont été peu étudiées chez les mycobactéries. Pourtant ces enzymes jouent un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles. M. tuberculosis possède une enveloppe très riche en lipides et est reconnue comme ayant un rôle majeur dans la virulence. Des lipides se retrouvent aussi dans des unités de stockages, les corps d'inclusions lipidiques (CIL), composés de triacylglycérols (TAG) et de cires. Ces CIL apparaissent lors de la phase d'infection et disparaîtraient lors de la phase de réactivation. De plus, il a été décrit que les phospholipides membranaires de la cellule hôte peuvent être hydrolysés par des phospholipases C (PLC) de M. tuberculosis, libérant ainsi des diglycérides (DG), substrats potentiels de lipases. La disparition des TAG, des CIL ainsi que celle des DG extracellulaires générés par les PLC, suggère l'existence de lipases intra et extracellulaires. Cette synergie entre PLC et lipases, déjà décrite chez un autre pathogène Pseudomonas aeruginosa, n'a jamais été étudiée chez M. tuberculosis. Ces lipases pourraient avoir un rôle dans la croissance et/ou la virulence, en hydrolysant soit les lipides contenus dans les CIL soit les lipides extracellulaires provenant des cellules hôtes. Les acides gras libérés pourraient servir de source de carbone et jouer un rôle dans la croissance, mais aussi être des précurseurs des lipides de l'enveloppe et avoir un rôle dans la virulence. Enfin, ces lipases pourraient permettre le maintien des bacilles en état de latence, les granulomes contenant des substrats de (phospho)lipases. Ce projet concerne l'identification de ces lipases, la détermination de leur rôle physiologique, leur implication dans la croissance, leur rôle dans ces processus de réactivation et de virulence et l'étude de la synergie entre lipases et PLC. Ces résultats permettront de répondre à la question essentielle: les lipases sont elles des cibles thérapeutiques potentielles ? Environ 28 gènes codants pour des lipases potentielles et les 4 gènescodant pour les PLC ont été sélectionnés à partir du génome de M. tuberculosis, un certain nombre a déjà été cloné et exprimé dans le système d'expression hétérologue d'E. coli. D'autres systèmes d'expression hétérologue disponibles au laboratoire comme baculovirus cellules/d'insectes ou Pichia Pastoris sont également utilisés. Une l'ensemble de ces gènes clonés et exprimés, les protéines recombinantes seront caractérisées biochimiquement. Le rôle in vivo des enzymes lipolytiques établies biochimiquement sera étudié par la construction de souches mutantes dont le gène aura été invalidé chez M. tuberculosis, M. smegmatis ou M. Bovis BCG. L'analyse du métabolisme des lipides des souches mutantes qui sera réalisée par spectrométrie de masse, sera comparée à celui des souches sauvages. Des anticorps spécifiques seront produits contre les différentes lipases identifiées et permettront des études d'immuno-cytolocalisations. Les techniques de gel bidimensionnel et d'immunoréactivité à l'aide de ces anticorps spécifiques permettront de valider les mutants. Enfin la capacité des souches mutantes à se réactiver pourra être étudiée sur des cultures de macrophages et par microscopie électronique. Les lipases recombinantes perm