Etude du mécanisme moléculaire de la transduction du signal dans les récepteurs canaux par pontage chimique – Piégétat

La communication neuronale est assurée par des protéines allostériques transmembranaires qui convertissent la liaison d’un neuromédiateur en l’ouverture rapide d’un canal ionique situé à plusieurs Å environ du site de liaison. Parmi ces protéines, on distingue les récepteurs canaux pentamériques ou récepteurs de la famille « Cys-loop ». Depuis la découverte et la cristallisation de l’acetylcholine binding protein (AChBP), protéine soluble homologue au domaine N-terminal de ces récepteurs canaux, des progrès considérables ont été effectués sur les relations structure-fonctions de ces récepteurs. Cependant les bases structurales du mécanisme moléculaire à l’origine de l’activation rapide (passage de l’état de repos à l’état actif ou canal ouvert) et de désensibilisation lente (passage de l’état actif à l’état désensibilisé) demeurent encore inconnues. Nous proposons d’étudier ces mécanismes en combinant les méthodes biochimiques de pontages chimiques de mutants cystéine par des agents pontants de tailles définies, aux méthodes d’enregistrements électrophysiologiques (patch-clamp). Dans un premier temps, nous allons créer une série de mutants cystéine sur des positions bien définies dans le récepteur à l’aide des modèles tridimensionnels (3D) élaborés au laboratoire. Puis en ajoutant un agent pontant, bi-fonctionnalisé par des groupements spécifiques des fonctions thiols séparés par un bras espaceur de taille connue, en absence (état de repos) ou en présence (état actif/désensibilisé) d’un agoniste, il sera possible de piéger les différents états fonctionnels du récepteurs. En variant la taille du bras espaceur (de 5 à 21 Å) ainsi que la position étudiée, nous envisageons d’accumuler de manière systématique des données de distances pour chaque état. Toute variation de distance entre les cystéines introduites sera interprétée comme changement conformationnel du récepteur au cours de la transition étudiée. Enfin, ces données seront analysées à la lumière de nos modèles moléculaires 3D. Ainsi, les contraintes géométriques accumulées expérimentalement permettront de restreindre les différents mécanismes théoriques plausibles et de proposer un mécanisme de transition allostérique d’activation et de désensibilisation.