Système acellulaire comme modèle d'étude de l'activation de la NADPH oxydase – Cell-free NOX

Notre projet de recherche concerne l'étude d'un complexe multiprotéique essentiel du système immunitaire présent dans les cellules phagocytaires : la NADPH-oxydase. Notre objectif est de comprendre le fonctionnement complexe de cet enzyme qui associe des transferts d'électrons (et de protons) à une dynamique protéique en utilisant une double approche structurale et fonctionnelle, menée sur un système acellulaire (in vitro). Inactive dans la cellule au repos, cette enzyme a pour fonction de produire des anions superoxydes (O2.-) en réponse à une infection bactérienne. Son activité est finement contrôlée par une dynamique d'assemblage de protéines cytosoliques vers leur partenaire membranaire, le flavocytochrome b558 (hétérodimère fixant différents composants redox). Cet assemblage entraîne le transfert d'électron du substrat, le NADPH, à l'accepteur final, l'oxygène pour produire O2.-. L'absence ou le disfonctionnement de la NADPH-oxydase sont associés à de nombreuses pathologies. Ce complexe membranaire constitue donc une cible de choix pour des approches thérapeutiques. Si, dans son ensemble, le fonctionnement de la NADPH-oxydase au niveau cellulaire est compris, au niveau moléculaire les connaissances structurales et fonctionnelles de ce complexe enzymatique restent très fragmentées, notamment au niveau du flavocytochrome membranaire. Elles n'autorisent encore que des hypothèses sur les mécanismes d'assemblage, la localisation exacte et la coordination des divers partenaires redox. Ce projet met en jeu un large éventail de compétences et d'approches expérimentales (génie génétique, biochimie structurale, spectroscopie d'absorption et de fluorescence), qui pour certaines ne sont encore que peu appliquées à l'étude de la NADPH-oxydase. La surexpression hétérologue et la purification biochimique des différentes sousÓunités cytosolique permettent déjà la mise en place d'un système semi-acellulaire. Nous avons d'ors et déjà montré que ce système fonctionne, en suivant la formation d'anion superoxide par les techniques de spectroscopie résolue en temps (absorption et fluorescence). La technique de stopped-flow sera utilisée pour déterminer finement les propriétés physico-chimiques du complexe (activé et au repos) et caractériser les interactions substrat-protéine qui sont encore imprécises. Pour apporter des éléments de compréhension aux mécanismes d'activation ou d'inhibition de l'enzyme et aux interactions protéine-protéine, nous utiliserons l'oxidase dans différentes conditions environnementales (pH, Ca2+, membrane, force ionique...). Les changements induits par ces dernières seront également suivis via les variations de fluorescence de sondes fixées aux sous-unités cytosoliques. Enfin, le flavocytochrome b558 est le centre redox catalytique de la NADPH-oxydase. Son rôle clé justifie les efforts que nous avons l'intention de réaliser pour mettre au point les outils de production et de purification du flavocytochrome membranaire (recombinant et natif). Différents systèmes d'expression de protéines seront explorés tels que les systèmes procaryote (E. coli, Rhodobacter) ou eucaryote (pichia pastoris). Cette mise au point méthodologique est nécessaire pour des objectifs à plus long terme visant à déterminer la structure du flavocytochrome et à comprendre son fonctionnement au niveau moléculaire. Ce projet a pour ambition d'approfondir les connaissances structurales et dynamiques de la NADPH-oxydase, ainsi que d'apporter des informations importantes sur les mécanismes réactionnels d'activation conduisant à la production d'O2.-.