Régulation redox : Enzymologie moléculaire et structurale de nouvelles enzymes à activité sulfinyl réductase – Sulfiredox

Contexte scientifique et objectifs: La sulfinylation du groupement thiol des Cystéines dans les protéines a longtemps été considérée comme un événement irréversible in vivo, jusqu'à la découverte de nouvelles activités enzymatiques de type sulfinyl réductase, nommées Sulfirédoxine (Srx) et Sestrine (Sesn), capables de réduire un acide sulfinique (-SO2H) en acide sulfénique (SOH). Chez les eucaryotes, la classe des peroxyrédoxines dites typiques à 2 cystéines (2-Cys Prx), des peroxydases à thiol capables d'éliminer le peroxyde d'hydrogène H2O2, est susceptible à la suroxydation de la Cys catalytique à l'état d'acide sulfinique, et constitue le substrat spécifique de Srx et des sestrines. Or H2O2, une espèce réactive de l'oxygène, peut jouer à la fois un rôle toxique et carcinogène et un rôle dans la signalisation cellulaire. Les sulfinyl réductases peuvent potentiellement réguler plusieurs aspects de la physiologie de H2O2 qui impliquent des Prx chez les eucaryotes, en régénérant l'état natif des 2-Cys Prx. Le rôle essentiel et la portée médicale des sulfinyl réductases sont attestés par le fait que le niveau d'expression des 2-Cys-Prx est modifiée dans de nombreux types de cancers et maladies neurodégénératives. De plus, l'expression des Sesn est contrôlée par le suppresseur de tumeurs p53 chez l'homme. Bien que structuralement non-apparentées, les deux types d'enzymes semblent posséder des propriétés catalytiques similaires, puisqu'elles dépendent d'un résidu Cys essentiel, et de l'ATP. Un mécanisme catalytique hypothétique a été proposé, dans lequel la fonction acide sulfinique est activée par phosphorylation, avec consommation concomitante d'ATP, et formation d'un intermédiaire covalent Prx-Srx de type thiosulfinate, suivie de la réduction par la Trx ou un autre réducteur. Dans ce projet, l'enzymologie moléculaire et structurale des Srx et Sesn sera étudiée, incluant la caractérisation du mécanisme catalytique et les facteurs structuraux et moléculaires impliqués dans la reconnaissance entre les partenaires de la catalyse, Prx, ATP et Srx/Sesn, et potentiellement le partenaire de recyclage. Le projet implique la collaboration entre une équipe d'enzymologie moléculaire (partenaire 1, G. Branlant) et une équipe de biologie structurale RMN (M.T. Cung, partenaire 2). Description du projet: 1. Etude du mécanisme catalytique des Srx et Sesn (partenaire 1) : Le mécanisme catalytique hypothétique sera testé étape par étape pour les deux enzymes, par des approches cinétiques (réactions enzymatiques couplées) combinées à la caractérisation des intermédiaires si possible. 2. La catalyse chimique par les Srx et Sesn (partenaire 1): L'identification du rôle de résidus dans la catalyse sera abordée par une approche structure-fonction par mutagenèse dirigée, sur la base de structures 3D connues (pour Srx) ou d'un modèle 3D (pour la Sesn2). La caractérisation cinétique des protéines mutées impliquera d'abord l'identification de l'étape cinétiquement limitante de la réaction. Les conséquences des mutations de Srx et de la Sesn2 sur le mécanisme enzymatique seront testées étape par étape en utilisant les méthodes mises au point dans l'objectif 1, pour déterminer quelle(s) étape(s) est (sont) affectées, résultant potentiellement en un changement de l'étape limitante de la réaction globale. Le rôle d'ionisations de résidus du site actif sera également recherché par des études de vitesse en fonction du pH. 3. Détermination de la structure de la Sesn2: La détermination de la structure et de la dynamique en solution de la Sesn2, nécessaire pour l'analyse rigoureuse des facteurs moléculaires impliqués dans la catalyse, sera entreprise par RMN (partenaire 2), sur le fragment 1-210 de la protéine. Parallèlement, la structure complète de Srx sera étudiée par RX (partenaire 1). 4. Caractérisation structurale de complexes ternaires enzyme-ATP-Prx: Une approche par RMN sera développée sur des complexes non-covalents entre Srx ou Sesn2, la PrxSO2 corres