Etude des ARN Polymérases ARN dépendantes impliquées dans les mécanismes d'inactivation épigénétique chez les plantes. – AtRDRProject

Les ARN Polymérases ARN dépendantes (RDR) jouent un rôle clef dans plusieurs voies de 'RNA silencing' chez les plantes, les champignons et certains animaux. Chez les organismes eucaryotes, le 'RNA silencing' est un système de surveillance activé par des ARNs double-brin (ARNdb) qui sont découpés par une ARNase spécifique des ARNdb (Dicer) en petits ARNs régulateurs appelés siRNA (small interfering RNA). Les siRNAs produits sont ensuite incorporés dans un complexe induisant le 'RNA silencing' (RISC pour RNA induced silencing compex) qui dégrade les ARNs portant des complémentarités de séquence avec les siRNAs. Le 'RNA silencing' a un rôle dans la défense des cellules eucaryotes contre les molécules d'ARN exogènes type ARN viral ou ARN de transposons. De plus, des travaux récents indiquent que des phénomènes de type 'RNA silencing' sont impliqués dans la régulation de gènes endogènes et dans le contrôle épigénétique de la structure de la chromatine. Les RDRs sont phylogénétiquement distinctes des RdRPs virales impliquées dans la réplication des virus et leur découverte chez les plantes, les animaux et les champignons suggère qu'elles ont évolué à partir d'un ancêtre commun eucaryote. La connaissance approfondie de leur fonction est cruciale puisqu'elles sont impliquées dans la régulation et la stabilité du génome ce qui suggère leur intervention dans la structure et l'évolution des génomes eucaryotes. Une caractéristique intéressante des RDRs de plantes est qu'elles possèdent différentes activités. Par exemple chez S pombe, l'unique RDR, Rdp1, est impliquée dans le RNAi (RNA interference) et dans la formation de l'hétérochromatine par un phénomène similaire au RNAi (RNAi nucléaire). Chez les plantes, au contraire, AtRDR2 et AtRDR6 sont requises, respectivement, pour le RNAi nucléaire et pour l'inactivation épigénétique post-transcriptionnelle (PTGS). Les raisons de cette différence, qui pourraient être une spécificité différente pour certains substrats ou l'interaction avec d'autres protéines, ne sont pas connues. Actuellement seul un travail sur la caractérisation de la RDR1 de tomate et un travail sur une activité dans des extraits de germes de blé ont été publiés, chacun montrant une synthèse d'ARN in vitro sans amorce et avec amorce. Chez Arabidopsis, en dépit de la découverte de toutes les voies connues de 'RNA silencing', il n'y a aucune donnée biochimique et structurale sur les RDRs. Des spécificités différentes pour le substrat pourraient résulter de caractéristiques biochimiques et structurales différentes, de la localisation cellulaire ou d'interactions avec les acteurs des différentes voies de RNA silencing. Un des objectifs de ce projet est donc d'étudier les caractéristiques biochimiques et structurales des différentes RDRs d' A. thaliana. Nous allons donc produire et purifier des AtRDRs recombinantes chez les bactéries. Des tests d'activité seront réalisés en utilisant des substrats artificiels et naturels. La détermination de la structure donnera de nombreuses informations telles que l'identification du domaine de liaison à l'ARN, l'identification des résidus impliqués dans la liaison des ions métalliques du site actif ou d'éventuels sites de liaison du GTP. Nous réaliserons ensuite une mutagenèse dirigée basée sur les données précédentes pour confirmer l'importance et le rôle des acides aminés des différents domaines identifiés. La spécificité de substrat et l'implication des AtRDRs dans les différentes voies du 'RNA silencing' peuvent résulter de l'interaction des RDR avec les composants de ces voies. Par exemple, la fonction de AtRDR2 est associée à celle de DCL3 afin de produire des siRNAs impliqués dans la formation de l'hétérochromatine, ainsi une interaction entre ces deux protéines pourrait expliquer cette association. Récemment, une interaction entre DCL1 et HYL1 (une protéine de liaison à l'ARNdb) a révélé le rôle d'HYL1 dans l'efficacité et la précision du clivage des pri-miRNAs via l'interaction avec D