Reprogrammation de l'ARN messager par trans-épissage: Evaluation in vitro et in vivo à l'aide de vecte scAAV. – Trans-épissage

1- contexte scientifique et objectifs du projet : L'Unité INSERM U649 (« Vecteurs Viraux et Transfert de Gène in vivo ») au CHU de Nantes évalue la possibilité de corriger phénotypiquement des maladies génétiques dites « monogéniques », en particulier en utilisant comme vecteur viral l'Adéno-Associated Virus recombinant (AAVr). Une des possibilités pour redonner sa fonction à une protéine passe par une réaction appelée Spliceosome Mediated RNA Trans-splicing (SMaRT), durant laquelle un épissage entre deux molécules distinctes d'ARN pré-messagers a lieu. Cette réaction nécessite la présence d'une molécule d'ARN appelée « Pré Trans-splicing Molecule » (PTM) introduite de façon artificielle dans les cellules. Notre hypothèse actuelle est de déterminer si la reprogrammation de gènes défectifs peut être effectuée, in vitro puis in vivo, par l'apport de PTM, dans le modèle de la mucopolysaccharidose de type VII (MPS VII). 2- description du projet, méthodologie : Les études précédentes ne portant que sur la reprogrammation par trans-épissage à l'aide de PTM5' et 3', nous avons tout d'abord testé la faisabilité du trans-épissage en utilisque globale d'étude du trans-épissage à l'aide deant des doubles PTMs, qui permettent le remplacement d'un exon interne, ceci dans une logis trois types de PTMs existants. L'intérêt de l'utilisation des doubles PTMs réside dans le fait que ce sont des molécules dont la taille n'excéde pas 1 à 1,5 kb. La cassette d'expression d'un double PTM peut donc être facilement insérée dans un vecteur AAV de type sc (self complementary), dont la taille maximale d'empaquetage est de 2,3 kb mais qui présente un potentiel de transduction supérieur aux vecteurs AAV classiques de type ss (single-stranded). Ce n'est pas le cas des PTM 5' ou PTM 3', qui sont généralement d'une taille bien supérieure, puisqu'ils doivent contenir soit la partie 5', soit la partie 3', de l'ADNc du gène à corriger. L'évaluation de la faisabilité du double trans-épissage a été réalisée in vitro sur un modèle simple, soit un gène composé de trois exons et de deux introns et codant pour une protéine ß-galactosidase non fonctionnelle. Nos résultats montrent que le double trans-épissage est un mécanisme qui peut en effet être utilisé pour la correction de défauts génétiques. Nous sommes actuellement dans le cœur de notre projet avec l'évaluation de l'efficacité de correction du messager codant pour la ß-glucuronidase par trans-épissage, dans les modèles canins et murins de la MPS VII. 3- résultats attendus : Nos premiers résultats montrent que la correction du messager GusB par trans-épissage, est possible in vitro, au moins dans le modèle canin. Malheureusement, la détection des molécules issues du trans-épissage est souvent rendue difficile, à la fois par le fait que le messager endogène ciblé est faiblement présent, et par le fait que les messagers mutés et corrigés ne diffèrent que par une seule paire de bases, ce qui rend leur discrimination particulièrement délicate. C'est pourquoi, nous avons fait le choix de mettre en place une nouvelle stratégie d'étude, utilisant à la fois des minigènes GusB et des PTM portant des séquences dégénérées et la séquence d'un épitope. Cette nouvelle approche nous permettra de pouvoir évaluer l'efficacité et la spécificité de nos réactions de trans-épissage dans un meilleur contexte de détection. Une amélioration de l'efficacité et de la spécificité de ces réactions sera envisageable grâce à différentes modifications des PTMs. Les PTMs les plus efficaces seront finalement évalués pour la correction in vivo du messager ß-glucuronidase, après transfert dans le foie de chiens et/ou de souris MPS VII à l'aide de vecteurs recombinants AAV ss ou sc de sérotype 8. Si cette technique s'avère efficace dans la reprogrammation de gènes défectueux, un élargissement est possible à un grand nombre de maladies génétiques monogéniques humaines, et notamment aux maladies dont l'ADNc correspondant au gène en cause est trop